MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA.

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La primera enzima en ser cristalizada fue la Ureasa en 1926 por Summer, esto fue seguido por la purificación y aislación de proteasas como la tripsina y pepsina por Northrop.

Las enzimas son moléculas orgánicas constituidas por aminoácidos proteicos que actúan como catalizadores biológicos, la secuencia de aminoácidos por la que están constituidos dotaran a la enzima de diversas características físico-químicas específicas, conocer estas cualidades permite diseñar un protocolo eficiente para la extracción, purificación e inmovilización.

Las enzimas tienen amplias aplicaciones a nivel científico e industrial: láctea, textil, cervecera entre las más destacadas, en la actualidad no se ha podido sintetizar en el laboratorio, por esta razón deben ser obtenidos de organismos vivos; hongos, plantas y bacterias.

En el presente trabajo se estudia, detalla y analiza los métodos comunes de extracción, purificación e inmovilización de enzimas. Estos preparan a dichas proteínas para ser utilizadas en varias aplicaciones en los campos descritos anteriormente.

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MARCO TEÓRICO:

4.1 GENERALIDADES:

El proceso para el aislamiento y la purificación de enzimas esta compuesto de distintas etapas como son la preparación de la muestra, la extracción de la enzima, el aislamiento y su purificación e inmovilización. En cada una de las etapas se lleva a cabo de forma específica, de acuerdo a la muestra que se posea. (Sinche, 2009).

4.1.1 Medidas de actividad

El tiempo y el éxito de un aislamiento, dependen en mucho del método de ensayo usado. La concentración de un enzima en un extracto crudo no es medible normalmente por un método directo, tal como un ensayo colorimétrico, y debe recurrirse en su lugar a la determinación de su actividad. Pero es posible realizar una medida directa espectrofotométrica de la absorción debida a un grupo prostético, por ejemplo, en el caso de las hemoproteínas catalasa, peroxidasa y citocromos.

Por su gran rapidez, simplicidad, especificidad y sensibilidad, prácticamente cualquier tipo de ensayo óptico es el método de elección para conocer los registros de actividad de una enzima. Otros métodos usados son las volumetrías y las medidas de intercambio de gases. Por lo general se utiliza el espectrofotómetro.

4.1.2 Medidas de la pureza

El grado de incremento puede ser expresado en unidades/peso seco. La determinación del peso seco es difícil y frecuentemente incluye sales sin importancia desde el punto de vista de la pureza, puesto que pueden ser dializadas en el momento que se desee. Los métodos frecuentemente usados son: nitrógeno total por Kjeldahl, precipitación por ácido tricloroacético, determinación de tirosina, y biuret.

4.1.3 Material de partida

La disponibilidad y coste del material de partida es siempre de importancia primordial. Puesto que la concentración de un enzima determinada puede variar enormemente en distintos tejidos, es importante escoger aquel en que el enzima se encuentre en mayor concentración. Enzimas de plantas y de microorganismos generalmente son más baratas, porque los tejidos animales son un fuente más costos para la producción comercial de una enzima aislada esto se debe a que muchas veces el animal debe ser sacrificado antes de que un tejido especifico u órgano pueda ser asilado y utilizado como fuente de la enzima. Una ventaja adicional es que pueden ser cultivados en condiciones favorables para la mayor producción del enzima en cuestión.

4.1.4 Aislamiento y purificación

En general estos métodos son requeridos por las siguientes razones

- Para el estudio de varios aspectos de una enzima en partículas.

- Identificación de sustratos y de sustratos específicos de la enzima.

- Evaluar el roll de varias coenzimas o cofactores en el momento de la reacción.

- Propósitos terapéuticos.

- El desarrollo del sistema de enzimas inmovilizadas para aplicaciones industriales, fermentaciones y valoración procesos.

- Enzimas puras también son empleadas en estudios forenses, procesamiento de alimentos, y para la síntesis de antienzimas las cuales tienen valor médico.

- los estudios de inhibición de enzimas pueden indicar potencial inhibidor los cuales pueden ser usadas para el tratamiento metabólico y desordenes hereditarios.

El aislamiento de enzimas extracelulares es sencillo que el de las enzimas extracelulares, debido a que estas son más fáciles de recolectar ya que no se requiere de la destrucción de tejidos y por lo tanto reduce costos y tiempos requeridos para procesos como la homogenización y cualquier otro tipo de procesos.

4.1.5 Metodos de Aislamiento y purificación

Esto varía de acuerdo muchos criterios los cuales incluyen la fuente de enzima, su disponibilidad, los procesos económicos, el factor tiempo y los requerimientos de instrumentación. Estos deben ser tratados a los siguientes puntos:

- identificación de la fuente de enzimas.

- Procesos generales de manipulación para la fuente y extractos puros.

- Métodos de aislamiento.

- Métodos purificación

- Desarrollo de ensayos: cualitativo y cuantitativo.

- Estabilización y cristalización.

- Criterio de pureza.

- Métodos de preservación de enzimas aisladas.

4.2 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN:

Una vez establecidos los parámetros anteriores y que se haya seleccionado correctamente el material de partida, la siguiente etapa en el proceso es la extracción de la enzima.

A continuación se mencionan algunos ejemplos de los principales métodos de extracción:

4.2.1 Autolisis:

Es un proceso biológico en el cual la célula realiza un proceso de autodestrucción, ya que estas células