AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

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- Viabilidad celular.- mide la proporción de células vivas; en la práctica para la determinación utilizamos el método de tinción con azul Tripan, Proporción-suspensión: tinte 1:1→ 10µL de colorante y 10µL de suspensión de células. El Azul Tripan es un colorante vital que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura o daño en la membrana plasmática; así, las células que aparecen en el microscopio de color azul, son consideradas no viables.

La cámara de Neubauer o Hemacitometro es utilizada generalmente para el conteo de células sanguíneas, pero también puede ser utilizado para el conteo de otros tipos celulares, esta cámara se adapta al microscopio óptico lo que nos permitirá realizar el conteo de células mononucleares y así determinar el porcentaje de viabilidad celular.

La determinación de la viabilidad celular es importante debido a que las células polimorfonucleares son de vida corta (vida media aproximada de 6 a 8 horas) y el conocimiento de este aspecto es importante en caso de realizar estudios de citotoxicidad.

Ahora bien, finalizada la práctica, y después del conteo celular, obtuvimos un 100% de VIABILIDAD CELULAR; sin embargo, no se debe olvidar que el método utilizado es un método cualitativo, además que en el recuento celular hubieron muchas dudas al considerar o no una célula muerta, a pesar de ello, nos quedamos con el resultado arriba mencionado.

- Ajuste de concentración celular.- Para realizar este paso, es preciso contar con una viabilidad celular dentro del un rango de 90-100%, este rango fue obtenido (100%) y para el cálculo de la concentración celular o densidad celular utilizamos el Factor 105, producto de la utilización de la cámara de Neubauer. Además realizamos los cálculos necesarios para llegar a la concentración recomendada para realizar el trabajo que es de 2,5 x 106 cel/mL.

4. CONCLUSIONES

Con el desarrollo de la práctica logramos determinar el porcentaje de viabilidad celular y realizar ajuste de concentración celular utilizando el Método Ficoll-Hypaque y Perlas Magnéticas con ayuda de la cámara de Neubauer. Finalmente, relacionamos el porcentaje de viabilidad celular para hacer cálculos de la concentración celular deseada.

5. CUESTIONARIO

1. Explique en qué consiste el aislamiento de células por selección positiva y selección negativa con perlas inmunomagnéticas?

En la técnica de separación celular magnética, los anticuerpos específicos se conjugan con partículas magnéticas y se unirán a las células que expresan el antígeno diana. La aplicación de un campo magnético atraerá a las células hacia el imán, separándolas del resto de las poblaciones celulares. Alternativamente, se puede realizar un proceso de separación de dos pasos, por ejemplo, utilizando anticuerpos conjugados con biotina seguido de partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

La separación de las células puede ocurrir a través de “selección positiva” o “selección negativa”. Esto depende de si los anticuerpos ligados a las nanopartículas magnéticas se dirigen directamente a las células de interés (selección positiva) o a las células no deseadas (selección negativa).

2. ¿Por qué los Linfocitos B y no así los Linfocitos T se quedan adheridos a la lana de nylon cuando se separan estos tipos celulares por el método de aislamiento celular por columna de lana de nylon?

Los linfocitos B están en sangre periférica en un 10-20%, y el 70% restante corresponde a los linfocitos T. En 1977, en el Dr. Werner diseño un procedimiento (que no se conoce muy bien el porqué ocurre exactamente) para aislar Linfocitos T y B a partir de células mononucleares de sangre periférica (Linfocitos B y T, y monocitos), basado en la adherencia diferencial de Linfocito B, Linfocitos B y monocitos a la lana de nylon a 37°C, los linfocitos T no se adhieren a la lana de nylon, los monocitos se adhieren a la lana de nylon y no se pueden separar de esta, y los linfocitos B se adhieren a la lana de nylon pero se pueden separar de esta ejerciendo presión mecánica sobre la lana y el medio líquido sobre el que se realiza el proceso.

3. ¿En qué consiste el aislamiento celular por el método Percoll, a qué densidad usted separaría linfocitos T, monocitos, neutrofilos y eosinofilos?

Consiste en la separación por densidad de forma más eficiente. Se emplea para el aislamiento de células, orgánulos y/o virus mediante centrifugación en gradiente de densidad. Está técnica fue formulado inicialmente por Pertoft y consiste en partículas de sílice coloidales de 15-30 ni de diámetro (23% m/m en agua) rodeadas de polivinilpirrolidona (PVP). El Percoll es adecuado para experimentos en gradiente de densidad, ya que posee una viscosidad baja comparada a compuestos alternativos, así como una baja osmolaridad y nula toxicidad para las células o sus componentes.

Para las siguientes células, utilizaría la densidad de:

- Linfocitos T - 1,077g/dL

- Monocitos - 1,077g/dL

- Neutrofilos - 1,090g/dL

- Eosinofilos – 1,077g/dL

4. ¿Que clusters de diferenciciación caracteristicos de los Linfocitos T y linfocitos B, recomendaría usted marcar con anticuerpo monoclonal para aislar por separado estos dos tipos celulares?

- Linfocitos T- CD1, CD2, CD3. cD4, CD6, CD8 y CD16

- Linfocitos B- CD1, CD21, CD 45 y SWC7

5. Mencione al menos tres aplicaciones que podría tener el aislamiento de un determinado tipo celular en el campo del diagnostico clínico y en el campo de la investigación.

- realizar cultivos celulares in vitro

- mantenimiento de las células en bancos de células (bancos de células madre, bancos de esperma, etc.)

- Para la determinación de antígenos HLA de clase II, DR y DQ, por técnicas serológicas empleando LB.

- Investigación in vitro de células puras

6. Si necesitase aislar plaquetas a partir de sangre periférica, ¿a qué densidad utilizaría el Ficoll-Urografina?

Utilizaría una densidad entre 0,070-0,080 g/dL de Ficoll-Urografina, consiguiendo la situación de flotabilidad neutra y encontrando a las plaquetas en la interface de