AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE

LA CONCENTRACIÓN CELULAR

1. FUNDAMENTO TEORICO

Se han descrito diferentes métodos para separar leucocitos de eritrocitos entre ellos los métodos

basados en gradiente de densidad, reseteo, lana de nylon, selección positiva, selección negativa

entre otros. La separación de linfocitos de sangre periférica por centrifugación diferencial en un

gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque, es una técnica rápida con una pureza superior al 90% y

una viabilidad de prácticamente el 100% (95 – 100%). Las células obtenidas por este método se

denominan PBMC (peripheral blood mononuclear cells) esta técnica fue descrita inicialmente por

Boyum, también se usa para aislar linfocitos de otros fluidos de tejidos disociados. Cuando se

aíslan células mononucleares de sangre periférica es conveniente hacerlo a partir de la interfase

plasma-paquete globular (buffy-coat) permite enriquecer los leucocitos de la sangre de 8 a 10

veces.

Con esta técnica también pueden recuperarse los polimorfonucleares (PMN) que se obtienen

sobre la fracción de eritrocitos. Para ello deben lisarse los eritrocitos con cloruro de amonio. Los

PMN (1,085 – 1,090 g/dl) obtenidos deben ser resuspendidos y lavados en el medio deseado

(RPMI-SFB 10%). La sangre de algunos individuos puede tener características especiales, por ejemplo en pacientes

con artritis reumatoide u otras enfermedades inflamatorias, se observa plaquetas y monocitos

que tienden a agregarse. También, a veces, los eritrocitos pueden contaminar las capas de células

mononucleares, por cambios en la densidad de eritrocitos, (cambio del potencial Z de la

membrana) induciendo a la formación uniones de células formando una red que atrapa los

leucocitos. En estos casos es necesario depletar los eritrocitos (con dextrán al 5%) para permitir un

plasma rico en leucocitos.

Los linfocitos son, junto con los monocitos, las células de menor densidad (< 1,077 g/dl), por ello

utilizando gradiente de densidad se los puede separar y aislar. En la mayoría de las técnicas de

inmunología celular se aíslan linfocitos de bazo, macrófagos del peritoneo, el humanos la mayor

fuente para obtener linfocitos y monocitos es la sangre periférica a través de la punción venosa.

Los monocitos pueden ser aislados o enriquecidos a partir de sangre periférica y de otros fluidos

mediante centrifugación diferencial a baja fuerza gravitatoria, obteniendo como resultado

eritrocitos y polimorfonucleares en el pellet y en el sobrenadante los linfocitos, monocitos y

plaquetas. Posteriormente para separar los monocitos de linfocitos, se incuban en una caja Petri o

una caja de cultivo celular por 1 a 2 horas a 37°C y 5% CO2. Los monocitos se adhieren en la placa y

forman una monocapa que luego será separada por tripsinización o verseneización. En este

sistema los linfocitos pueden ser obtenidos antes de la tripzinización puesto que ellos representan

las células no adherentes. Otra técnica no muy utilizada para la separación de monocitos de

linfocitos es la capacidad fagocítica de los monocitos, por lo que se incuban las células sanguíneas

GUÍA DE LABORATORIO

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con hierro coloidal y posteriormente se acerca el tubo a un imán (es método de separación es

similar al descrito para las perlas magnéticas y selección positiva).

Muchos experimentos requieren que previamente se valore la viabilidad de las células a utilizar,

con el fin de corregir los valores obtenidos en un simple recuento de células. La membrana

plasmática de las células vivas no permite el paso de sustancias que no sean electrolitos, mientras

que las células que no mantienen la integridad de su membrana las dejan pasar y se colorean. Este

fenómeno se utiliza para distinguir células vivas de células muertas. Existen muchos marcadores

que se pueden utilizar, por ejemplo el azul de tripán PM 960 KDa, la nigrosina o la eosina, etc.

2. OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica, el alumno debe ser capaz de: formar un gradiente de