Aislamiento y seleccion de una cepa bacteriana degradadora de hidrocarburos a partir de suelo contamino por petroleo de Trompeteros
Enviado por monto2435 • 27 de Julio de 2018 • 1.475 Palabras (6 Páginas) • 576 Visitas
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Aislamiento y selección de cepas degradadoras de petróleo
El aislamiento de cepas bacterianas degradadoras de petróleo se llevará a cabo por el método de enriquecimiento secuencial, empleando como fuente de carbono y energía crudo de petróleo procedente de la refinería “La Pampilla”
El enriquecimiento se realizará empleando medio mineral modificado del medio diseñado por Zajic y col. compuesto por (g.L-1): KH2PO4 0,05; NH4Cl 0,1; K2HPO4 0,1; KH2PO4 0,05; KCl 0,01; MgSO4·7H2O 0,05; CaCl2 0,001; FeSO4·7H2O 0,001. Además, se le adicionará 0,05 mL de una disolución de oligoelementos de composición porcentual: B (0,026), Cu (0,05), Mn (0,05), Mo (0,006) y Zn (0,07). Como fuente de carbono se utilizará crudo de petróleo procedente de la refinería “La Pampilla”. Los componentes del medio serán esterilizados en autoclave a 120°C durante 20 min. Las disoluciones de oligoelemento serán esterilizadas a través de un filtro de 0,22 μmol/. En 50 mL de este medio, se preparará el pre-inóculo de 24 h de incubación, 1 mL de inóculo del cultivo a una longitud de onda de 600 nm equivale a una densidad óptica (DO) aproximadamente igual a 2 (DO600 nm ≈ 2).
Selección de las cepas degradadoras de petróleo
Se realizará la evaluación de su crecimiento en placas que contenían petróleo como única fuente de carbono y energía. Una vez aisladas las cepas, se procederá a estudiar sus capacidades biodegradadoras. Para ello, se llevará a cabo un ensayo de biodegradación con crudo de petróleo. Cada una de las cepas aisladas se incubaran en erlenmeyers de 100 mL (capacidad nominal) con 20 mL de medio mineral y 0,02 % (p/v) de crudo de petróleo y 0,5 g.L-1 de extracto de levadura. Se inocularan 100 μL de resuspensión de las cepas, a una turbidez equivalente de 0,9 unidades de absorbancia a 600 nm. Se utilizarán controles abióticos (sin inóculo). Los cultivos se incubarán en agitación horizontal a 150r/min, 30 ºC y en oscuridad durante 15 días. Además, se realizarán ensayos de crecimiento de las cepas aisladas, en placas con medio salino y naftaleno considerando que en la fracción aromática del petróleo utilizado es el compuesto más abundante. La actividad se evaluó midiendo el halo de degradación.
Determinación del crecimiento bacteriano
Para la determinación de la población microbiana, se utilizará el método de recuento directo en microscopio óptico, mediante la cámara de Neubawer. La visualización de las muestras del cultivo obtenido en el enriquecimiento secuencial para el aislamiento de cepas degradadoras de hidrocarburos, se prepararán llevando a cabo tinciones de Gram, técnica de tinción diferencial que permite clasificar las bacterias en Gram positivas y negativas, según el tipo de coloración que adquieran y se observarán las preparaciones en el microscopio óptico.
Identificación de microorganismos
El aislamiento de las cepas se realizará por siembra en estrías sobre placas de agar triptona soja (TSA), a partir de un banco de diluciones seriadas, las cepas se identificarán utilizando pruebas bioquímicas clásicas para determinar el género y la especie según el Manual Bergey’s.
Biodegradación de petróleo por la cepa aislada e identificada.
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F. Fecha de realización de la Tesis.
a) Inicio: b) Término:
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- Calendario e actividades.
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1. Búsqueda bibliográfica
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2. Desarrollo de la técnica analítica
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3. Monitoreo de la técnica de análisis
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4. Evaluación de la técnica analítica
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5. Redacción de la técnica analítica
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- Referencias Bibliográficas:
- Viñas M. Biodegradación de suelos contaminados con hidrocarburos: caracterización química, microbiológica y ecotoxicológica. Facultat de Biología, Departament de Microbiología, Universidat de Barcelona-España, 2005.
- Merino F. Estudio de microorganismos productores de emulsificantes de petróleo. UNMSM, Lima-Perú, (Tesis para optar por el título de magíster, 1998.
- Sirvins A. y Tramier B. La biodegradación de los hidrocarburos. Mundo Científico.1993
- Bergey’s. Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed., Williams and Wilkins, USA. 1994
- Rivera Cruz M.C., Ferrera-Cerrato R., Volke V., Rodríguez R. y Fernández L. Adaptación y selección de microorganismos autóctonosen medios de cultivo enriquecidos con petróleo crudo. Terra, 423-434, 2002
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