OBTECIÓN DE QUERATINASA BACTERIANA A PARTIR DE MUESTRAS DE SUELO Y ANALISIS DE PARÁMETROS ÓPTIMOS DE PRODUCCIÓN Y DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA.

...

- Obtención de extracto crudo de la enzima y purificación parcial de enzima de los microorganismos.

- Caracterización de la actividad queratinolítica en cepas seleccionadas.

- Estudio de parámetros óptimos para la producción de la enzima.

HIPÓTESIS

Existen microorganismos degradadores de queratina que pueden ser aislados para el estudio de su actividad queratinolítica

METODOLOGÍA

1. Toma de muestras y aislamiento de microorganismos

Toma de muestras a partir de suelo de granjas y plumas enteras. Posteriormente son llevadas a laboratorio para aislar microorganismos en medios de cultivo sólido

2. Preparación de queratina

A partir de las plumas enteras recolectadas realizaremos dos preparaciones para ser utilizadas como sustrato. La preparación de polvo de plumas a partir de pluma entera (Friedrich et al.,1999) ,además la preparación de queratina soluble (Wawrzkiewicz et al. ,1987).

3. Detección de actividad proteolítica y queratinolítica, Selección de cepa.

Se detectará la actividad proteolítica en agar caseína (Brandelli et al.,2006) y la actividad queratinolítica en medio mínimo suplementado con polvo de plumas o con queratina soluble.

4.- Identificación de aislados seleccionados con mayor actividad queratinolítica

Se identificarán los aislados seleccionados mediante pruebas bioquímicas.

5. Obtención del extracto crudo de la enzima

Se utilizaran cepas seleccionadas que se cultivarán en medio basal suplementado con queratina (Lin et al.,2001). La enzima se obtendrá del sobrenadante del cultivo utilizando centrifugación y precipitación con sulfato de amonio

6.-Ensayos enzimáticos

La actividad queratinolítica de los extractos se determinará utilizando queratina como sustrato (Wawrzkiewicz et al.,1987) y midiendo la concentración de aminoácidos liberados mediante el método de OPA (Roth, 1971)

7.- Caracterización del extracto crudo de enzima y rangos de acción.

Se utilizará el método de Bradford (Bradford, 1976) para cuantificar la concentración de proteínas en el extracto enzimático (determinación de la actividad específica).

Se caracterizará la actividad queratinolítica en los extractos determinando su temperatura y pH óptimos, estabilidad térmica.

Se determinarán los parámetros cinéticos, Km y Vmax estudiando la velocidad con diferentes concentraciones de sustrato.

Se estudiará el efecto de iones metálicos en la actividad de la enzima. (Vigneshwaran, 2010)

8.-Estudio de parámetros óptimos en la producción de la enzima

Se estudiarán algunas condiciones de cultivo para optimizar la producción de queratinasa (Sinoy et al.,2011)

PRINCIPALES MATERIALES y EQUIPOS

Medios de cultivo

Reactivos

Micropipetas

Centrífuga

Espectrofotómetro

Equipo de cromatografía

Estufas de incubación

CARTA GANT (Estimación aproximada)

Semanas →

05.11

12.11

19.11

26.11

03.12

10.12

17.12

07.01

14.01

25.02

04.03

11.03

18.03

25.03

01.04

08.04

15.04

22. 04

27. 05

Análisis secuencial proyecto a desarrollar

X

Toma de muestras y aislamiento de microorganismo

X

X

X

Preparar queratina

X

X

X

Detección de act. proteolítica queratino-

litica, selección de cepas

X

X

Caracterización e identificación de bacteria aislada

X

X

Obtención y extracción de de la enzima

X

X

Cuantifica-ción de actividad enzimática

X

X

Estudio de parámetros óptimos en la producción de la enzima

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Redacción conclusiones

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Desarrollo Hipótesis

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Presentación

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