Transformación de la cepa bacteriana DH5a con plásmido pENTER en presencia de Kanamicina

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Por otro lado, de acuerdo a los resultados observados (Tabla 1.) se registró una diferencia en el crecimiento de colonias en las 3 diferentes diluciones. Los datos obtenidos por los equipos 1 y 2 varían entre si y no corresponde a las diluciones, en el equipo 3 hubo una ausencia de datos debido a que se presentó un numero incontable de colonias. Se esperaba que los resultados en cada una de las diluciones se obtuvieran como se ven reflejados en los resultados obtenidos por el equipo 4, donde la dilución 2 únicamente presento el crecimiento de una colonia, la dilución 20 con 8 colonias de bacterias y la dilución 200 con 100 colonias, observándose en efecto un aumento de crecimiento de colonias entre más elevada sea la dilución. La comparación de las diferencias entre los datos se puede observar claramente en las gráficas 1 y 2(control), en la dilución 20 se presenta una convergencia aproximada entre los resultados de los equipos, mientras que en las diluciones 2 y 200 se aproximan resultados de dos equipos y uno se aleja totalmente del rango.

Cuestionario transformación de bacterias

- ¿Cuál es el centro de replicación del plásmido pENTER y cuántas bases abarca?

El plásmido pENTER está formado por 2580pb, dentro de este el centro de replicación pUC abarca de 1904-2577pb con un total de 673 pb.

- Si extraemos el plásmido de las bacterias transformadas y lo digerimos (cortamos) con Not I ¿Cual sería el tamaño en kilobases que esperamos encontrar?

De acuerdo con el mapa de restricción, la enzima Not I corta únicamente 1 vez en la posición 163. Not I tiene un sitio de reconocimiento de 8 pb, que ocurre aproximadamente 1 vez en 65.536 pb, a pesar de esto el corte de la enzima de restricción Not I no tiene ningún efecto en el tamaño del plásmido, por lo que las kilobases serían las mismas, es decir, si un kilobase es igual a 1000 pb y el plásmido pENTER está formado por 2580 pb, entonces el plásmido mide 2.58 kilobases.

- ¿Qué es un cassette de resistencia a kanamicina?

Los cassettes genéticos constituyen un grupo diverso de pequeños elementos móviles que usualmente contienen sólo un marco de lectura abierta completo (orf), o región codificante (gen). Además, formando parte de su estructura, a continuación del orf, existe un sitio de recombinación específica denominado elemento de 59 pb, o sitio attC, localizado en el extremo 3' del gen. Estos elementos pueden existir libremente en forma de moléculas circulares covalentemente cerradas, generadas por acción de la integrasa que escinde el cassette desde un integrón. La inserción específica de sitio de los cassettes genéticos al interior de la región variable de los integrones ha sido solamente detectada en las células que expresan la actividad de la integrasa (González et al; 2004). Los cassettes genéticos codifican resistencia a una amplia gama de compuestos antibacterianos, entre ellos la kanamicina la cual se encarga de inhibir la síntesis proteica en bacterias.

- ¿Por qué es importante obtener colonias aisladas?

La importancia radica en que al tener una colonia aislada su estudio y análisis es con una mayor facilidad, tal es el caso del conteo de colonias; si las colonias que se desarrollaron crecieron muy próximas entre sí, es muy difícil visualizar cuantas colonias se encuentran en esa área.

- De acuerdo al resultado que obtuvo tu equipo ¿qué concentración de plásmido utilizarías para transformar y por qué?

De acuerdo a los resultados obtenidos por mi equipo de trabajo, utilizaría la concentración de plásmido correspondiente a la dilución 200 para transformar a las bacterias, esto debido a que el número de individuos observados en colonias es mucho mayor a comparación de las otras diluciones, por otro lado la dilución 200 presenta un crecimiento regular ante las condiciones del antibiótico de Kanamicina que permite ser cuantificado correctamente.

Conclusiones

La Kanamicina resulta ser un poderoso inhibidor en cepas de DH5a debido a su sensibilidad, pero a pesar de esto, si las bacterias son transformadas con el plásmido pENTER pueden desarrollar una gran resistencia ante la condición de antibiótico en su medio.

Las transformaciones bacterianas le permiten al microorganismo desarrollar ciertas características adaptativas que son producto de la recombinación genética, las cuales les permiten sobrevivir ante diferentes condiciones ambientales, este fenómeno arroja muchas posibilidades donde los organismos pueden inhibir o provocar efectos de enfermedades, las cuales tienen una gran importancia para el bienestar social.

Referencias

- González G; et al. (2004) Integrons and resistance gene cassettes: structure and role against antimicrobials. Medicina Molecular. Rev Med Chile 132: 619-626.

- Invitrogen life technologies. Recuperado de: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/vectors/pentr_dtopo_rest.pdf

- Thermo Fisher Scientific. (2015). Recuperado de: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017

- Biologia Celular y Molecular Laboratorio No 5: Enzimas De Restricción, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Recuperado de: https://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/laboratorio-no-6-enzimas-de-restriccion.pdf

- Transformación Bacteriana. Recuperado de: http://smcg.ccg.unam.mx/actividades/divulgacion/1erTDCG_eldnavaalaescuela/doctos/3ra_sesion_TDCG.pdf

- Betancor L., et al. Genetica Bacteriana: Temas de bacteriología y virología médica. Recuperado de:

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/GeneticaBacteriana.pdf

- MCLAB, Molecular Cloning Laboratories. (1998). Recuperado de: http://www.mclab.com/Dh5-Alpha-Competent-E.-Coli.html

- Vidal Vademecum Spain. Madrid España. (2010). Reduperado de: http://www.vademecum.es/principios-activos-kanamicina-j01gb04

- Jauregui M. Kanamicina. Laboratorios Españoles de Farmacología Aplicada LEFA. Universidad Complutense. Recuperado de: http://pendientedemigracion.ucm.es/BUCM/far/kanamicina.pdf