Objetivo: Transferir el gen marcador de resistencia al antibiótico Tetraciclina y el gen que codifica para la expresión de la proteína verde fluorescente entre dos cepas de E. coli.

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6- En un experimento de conjugación se utilizaron cepas con los siguientes fenotipos:

cepa a= Hfr: Bio--Gal--Thr+-Arg+-Ampr

cepa b= F-: Bio+-Gal+-Thr--Arg--Rec--Amps

cepa c= F-: Bio+-Gal+-Thr--Arg--Rec+-Amps

a- Teniendo en cuenta que el carácter rec refiere a la capacidad de recombinación de la cepa, cuál sería el resultado de dos experimentos de conjugación por separado, uno de la cepa a con la cepa b, y otro de la cepa a con la cepa c. ¿Cuál sería el fenotipo resultante de los transconjugantes?

b- Indique el protocolo y los medios de cultivo utilizados en el ensayo de a- para seleccionar los transconjugantes.

7- Se realiza una conjugación entre una cepa F- que es bio--gal--his--leu- -trp- Sp R y un Hfr que es bio+-gal+- his+-leu+ -trp+ -Sp S. Se mezclan 0,1 ml de Hfr con 1,9 ml de F-, ambos provenientes de cultivos en caldos en fase logarítmica que contienen 5×108 UFC/ml. La mezcla de conjugación se incuba a 32°C durante 100 minutos y se seleccionan los transconjugantes bio+- his+ en una caja de Petri conteniendo el medio selectivo A. En dicha caja se sembraron 0,1 ml de la dilución 1/10 de la mezcla de conjugación. Después de incubar a 37°C una noche se contaron 170 colonias. Los transconjugantes bio+-his+ se estudiaron para determinar además cuantos eran gal+- leu+ -trp+. Para ello se replicaron con manguito de terciopelo las 170 colonias en las siguientes condiciones:

Medio de cultivo

Transconjugantes selecionados

N° de colonias obtenidas

B

bio+- his+-gal+

80

C

bio+- his+-trp+

80

D

bio+-his+-leu+

30

a- Con qué frecuencia aparecen los transconjugantes bio+- his+?

b- Indique la composición de los medios selectivos A, B, C y D.

c- Cuál es el orden relativo de los marcadores en el cromosoma?

8- Se cuentan con las siguientes cepas :

Cepa A: F-: lac--arg-- his--pyr- - lys--tonR

Cepa B: Hfr: lac+-arg+- his+-pyr+-lys+-tonS

El carácter lac— se refiere a la imposibilidad de fermentar la lactosa; arg-- his--pyr-- lys—: refieren a la imposibilidad de sintetizar arginina, histidina, pirimidinas o lisina respectivamente, y TonR refiere a la resistencia al fago (virus que infecta bacterias) virulento T1. Se realiza una conjugación entre la cepa A y la cepa B.

a. ¿En qué medios selectivos seleccionaría los recombinantes lac+-arg+?

b. Observando los resultados de la siguiente tabla determine el orden de entrada de los marcadores.

Marcador seleccionado

Número de transconjugantes cada 1000 Hfr

Arg+

350

Pyr+

100

Lac+

25

Lys+

350

His+

500

9- a) ¿Cómo aislaría bacterias auxótrofas para His (his-) de un cultivo de bacterias protótrofas? Y Cómo aislaría bacterias protótrofas para His (his+) de un cultivo de bacterias auxotróficas? Indique para cada caso medios, agentes selectivos y técnicas utilizados.

b)- Utilizando el mutágeno metil-nitroso guanidina se quiere obtener un mutante lac+ de una cepa de Salmonella tiphymurum lac-. Proponga un protocolo para realizar el ensayo especificando medios e indique cómo haría para calcular la y eficiencia de mutación.

c). Cómo es la eficiencia de una mutación espontánea con respecto a una mutación inducida por un mutágeno?.

10. Se realiza un ensayo de transducción generalizada y para ello se cuenta con el fago T8 que realiza dicha transducción y una cepa bacteriana sensible al fago que tiene un fenotipo trp--bio-- his--ade-. Se mezclan 0,5 ml de la cepa con 0,1 ml de un lisado de fagos (que proviene de una lisis de bacterias trp+-bio+- his+-ade+), en un volumen final de 3 ml de caldo nutritivo. El recuento inicial de bacterias es de 5 x 108 UFC/ml, y el de fagos 1 x 108 UFP/ml. Luego de 24 hs de incubación a 32 °C se plaqueó 0,1 ml de 3 diluciones seriadas de la mezcla en cajas conteniendo el medio A. Sólo en la dilución final de 1 x 10-3 se obtuvieron un promedio de 125 colonias.

a. Proponga la composición del medio A y en base a ello indique cuál será el número final de transductantes y su fenotipo. Tenga en cuenta que los caracteres trp-bio- his-ade se encuentran contiguos en el genoma bacteriano y pueden transmitirse juntos.

b. ¿Cuál fue la eficiencia de transducción?

11. Un cultivo de 1x108 UFC/ml de una cepa mutante de Pseudomona aeruginosa se plaquea en distintos medios, y luego de 2 días de incubación se obtienen los siguientes resultados:

Temperatura

Medio de cultivo

40°C

30°C

Mínimo

No se observa crecimiento

50 colonias

Mínimo más leucina

10 colonias

Crecimiento confluente

Medio rico

10 colonias

Crecimiento confluente

a. En base a los resultados

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