Biorremediacion de metales pesados mediante mezclas bacterianas

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7.0.2.2. Preparación de metales pesados solución madre.

Para la preparación de una concentración de 1 M de las mezclas de soluciones madre de metales pesados las cantidades necesarias de: CdCl2 · 5H2O (Kanto Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón.), PbCl2 (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón), y CaCl2 (Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Corea) fueron disueltas en agua Milli-Q. Todas las soluciones se filtraron a través de un filtro de 0,22 micras (Pall Co., MI, EE.UU.). Las concentraciones de trabajo de mezcla de metales pesados se obtuvieron mediante diluciones seriadas. Las soluciones madre se almacenaron en la oscuridad a 4◦C.

2.3. Medición de la actividad de la ureasa y la producción de calcita.

Las condiciones experimentales fueron las mismas que para el crecimiento de las mezclas bacterianas descrito anteriormente. Para establecer las mezclas bacterianas, primero, se añadió un cultivo bacteriano a los matraces experimentales y se incubó a 30◦C durante 24 h con agitación continua a 200 rpm. Se determinó la actividad ureasa usando el ensayo de fenol-hipoclorito (Natarajan, 1995). Se añadió la suspensión bacteriana (250 μl) a 250 μl de tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene 500μl de solución de urea a 3 M. La mezcla se incubó a 37◦C con intervalos de tiempo regulares. Posteriormente, 2 ml de solución de fenol nitroprusiato se añadio a una solución de hipoclorito alcalino, luego, se incubaron a 50◦C durante 40 min. Después de la incubación, se midió la Absorbancia a 626 nm con cloruro de amonio (0-10µM) como un estándar. Una unidad de actividad de la ureasa se definió como la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de 1 μM de urea por min.

Para producir calcita, los aislados se cultivaron en caldo de YA para 24 h y se subcultivaron en caldo de BPU (3 g de extracto / L de ternera, 5 g / L de peptona, y 20 g / L de urea a pH 7) a 30◦C durante 72 h con agitación continua a 200 rpm. Se añadió la suspensión bacteriana (500? L) a 500? L de una solución de dihidrato de cloruro de calcio a 350 mM y la mezcla se centrifugó a 16.179 × g durante 5 min a 25◦C para recoger el precipitado. Finalmente, el precipitado se secó a 50◦ C durante 48 h antes de ser pesado.

2.4. Determinación de la concentración mínima inhibitoria.

Los experimentos de tolerancia se llevaron a cabo en Erlenmeyers de 250 ml, que contienen cada uno 45 ml de caldo de YA. Aproximadamente el número igual de células de las cuatro cepas aisladas fueron utilizadas y las mezclas bacterianas con una densidad celular inicial de 1x108 cell/ml para cada una de las cepas aisladas. Todos los cultivos fueron incubados en 30 ºC y agitación a 200 rpm. Para estudiar la influencia de los metales pesados en el crecimiento bacteriano, las mezclas bacterianas fueron expuestos a una mezcla de metales pesados con concentraciones individuales que van desde 0 a 10 mM.

2.5. Prueba de impermeabilidad

Los cultivos individuales y las mezclas bacterianas cultivadas en caldo durante la noche se recogieron por centrifugación a 6000 rpm durante 5 min, se lavaron dos veces y se resuspendieron en una solución de cloruro sódico al 0,9% a una DO final 600 nm de 1,0 (equivalente a 1 × 108 células / ml). Se mezclo arena estéril (200 g, desde 0,45 hasta 0,7 mm, Joomoonjin Sand Co. Ltd., Corea) con 10 ml de urea (40 g / L) y una solución de cloruro de calcio dihidrato (25 g / L). La suspensión de arena (40 g) se empaquetó en una columna de plástico de 25 ml (Corning Co. Ltd., Corning, NY, EE.UU.). Después de ser secadas durante 48 horas a 50◦C, las columnas se recogieron una vez por gravedad con 10 ml de suspensión celular. Las columnas se almacenaron durante 48 para permitir el crecimiento de cristales de calcita. A continuación, 2 ml de cristal violeta (CV) se pipetearon en la columna de arena de relleno. El grado de permeabilidad se determinó mediante la medición de la distancia de migración de CV.

2.6. Biorremediación de metales pesados

Cinco mililitros del pre-cultivo de una noche se inocularon en 45 ml de caldo YA contenidos en erlenmeyers de 250 ml. El caldo YA contiene urea 5 mM y CaCl2 25 mM, que fueron filtrados usando filtros estériles de 0,22 μm, y fueron suplementado con 2 mM de mezcla de metales pesados. Los erlenmeyers fueron incubados en incubadora con agitación constante a 200 rpm a una temperatura de 30 ºC por 48 horas. Los tratamientos de control o blancos sin ningún tipo de células bacterianas fueron agregados también en todos los experimentos. Después de la incubación, los cultivos se centrifugaron a 8000 x g durante 15 min. La biorremediación de metales pesados por cultivos individuales y mezclas bacterianas (A3) se calculo como la diferencia porcentual entre las concentraciones iníciales y finales de los metales pesados presentes en los sobrenadantes. Las concentraciones de metales pesados se midieron usando un espectrómetro Perkin-Elmer OPTIMA-7300 DV óptico de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES, Perkin Elmer, Inc., EE.UU.).

2.7. Ensayo de columna.

Las muestras de arena de sílice se tamizaron, se lavan, se secaron al aire, y se esterilizaron antes de los experimentos. El pH de la arena en suspensión en agua destilada era 8,5. Se llevaron a cabo los estudios de biorremediación de metales pesados en columnas de 50 mm de diámetro y 500 mm de longitud (OMG Chemical Co., de Corea), que contenian 1,0 kg de arena de sílice suplementado con una mezcla de metales pesados a 2 mM. Los metales pesados se mezclaron en el fondo mientras que la arena en forma de solución. El cultivo de mezclas bacterianas (A3, equivalente a 108 CFU / ml) creció durante toda la noche en un caldo. El tratamiento de control consistía en la misma configuración como el tratamiento experimental pero sin la adición de las células bacterianas. La biorremediación se determinó midiendo el tiempo requerido para pasar a través de la columna 100 ml de urea a 5 mM y cloruro de calcio a 25 mM. El experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente (25◦C) y corrió durante 3 d. después de finalizar el experimento, las muestras de los efluentes se recogieron de la parte inferior de la columna con 100 ml de agua destilada. Las concentraciones de metales pesados en las muestras de los efluentes se determinaron mediante ICP-OES.

2.8. Análisis estadístico.

Los resultados se expresaron como la media ± S.D. de los tres experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, y se