Amplificación de ADN vegetal o bacteriano.

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2.1 Desnaturalización inicial. Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de desnaturalización (separación de la doble hélice porque los puentes de hidró- geno se rompen), la temperatura y el tiempo se determinan de acuerdo a las características del ADN y de la ADN polimerasa utilizada, por lo general es entre 94 y 96 °C durante 5-10 minutos.

2.2 Ciclos de la PCR. Se realizan ciclos sucesivos de desnaturalización, alineamiento y extensión, generalmente estas etapas se repiten entre 25 y 35 veces.

2.2.1 Desnaturalización. En esta etapa es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94 ºC durante 30 segundos a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto contenido de guaninas y citosinas, se recomienda aumentar el tiempo o la temperatura.

2.2.2 Alineamiento. Al disminuir la temperatura de incubación los iniciadores se unen al ADN molde en las zonas 3´complementarias. Ambos iniciadores se unen de manera específica al ADN flanqueando el fragmento que se quiere amplificar. En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los iniciadores: la concentración, el número de bases y el porcentaje de guaninas-citosinas. En la práctica, la temperatura de alineamiento oscila entre 45 y 65 ºC durante un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto.

2.2.3 Extensión. Esta etapa, también conocida como elongación, amplificación o polimerización, consiste en la síntesis de la nueva cadena de ADN, a partir del extremo 3’ del iniciador por acción de la ADN polimerasa, empleando como sustrato los cuatro dNTPs. En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72 ºC porque es la temperatura a la cual la Taq polimerasa (enzima más utilizada) alcanza su mayor actividad.

2.3 Extensión final. Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una última extensión de aproximadamente 5 minutos a 72 ºC para permitir que la polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.

3. Realizar electroforesis del producto obtenido.

Conclusión Es necesario seguir los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un protocolo establecido dependiendo del tipo de célula de nuestro interés, para conseguir una correcta amplificación de ADN.

Referencias

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