Aspectos generales de la tecnologia del ADN Recombinante

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Además de explorar las técnicas usadas para manipular el DNA, es fundamental considerar los aspectos éticos, económicos, ecológicos y políticos implicados. Manipular la genética de los organismos suscita dudas éticas y podría teóricamente causar daños. Órganos legislativos de todo el mundo están debatiendo la legislación necesaria para regular ambos aspectos. ¿Cuáles son los peligros y beneficios potenciales de introducir genes recombinantes en seres humanos, plantas alimenticias y otros organismos? Esta pregunta representa uno de los mayores desafíos éticos del siglo XXI, y es un tema muy recurrente.

Al develar los métodos mediante los cuales las células procesan, añaden eliminan y transfieren información genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas. Desde comienzos de la década de1970 se han desarrollado técnicas de ingeniería genética que permitieron analizar y manipular el DNA en una forma antes imaginada. Este conjunto de técnicas conocida como tecnología del DNA recombinante, permitió investigar a fondo la estructura y la función de los genes, es especial de los genes eucariontes, que eran inaccesibles por otros medios. Posibilito también, de manera repentina y contundente, una nueva comprensión de la genética humana, ya que esa tecnología, todavía joven, permite el diagnostico en muchos casos exacto de varias enfermedades hereditarias y, muy probablemente, su tratamiento exitoso en el futuro.

Enzimas de restricción.

Todos los organismos tienen enzimas que copian, corrigen, cortan, degradan, pegan y modifican las moléculas de DNA de las maneras más diversas. Estas enzimas le permiten a cada célula realizar funciones esenciales como replicar, reparar y expresar la información genética. Los biólogos moleculares se valen de las mismas herramientas que la célula para manipular el material genético, esto incluye aislar, copiar y transferir información genética de un organismo a otro. En cuanto descubrieron las enzimas que participaban en estos procesos, los investigadores las aislaron y las caracterizaron para utilizarlas en el laboratorio. En la actualidad, los biólogos moleculares cuentan con una batería de enzimas que les permite manipular los ácidos nucleicos con gran versatilidad.

Las enzimas de restricción se descubrieron a partir de los trabajos de suizo Werner Arber quien, en la década de 1960, estudiaba la especificidad de la infección de las bacterias por parte de un fago llamado lambda. En 1970, el estadounidense Hamilton O. Smith purifico las primeras enzimas de restricción y apenas un año más tarde el estadounidense Daniel Nathans utilizo una enzima de restricción para cortar y analizar el DNA del virus SV40. Arber Smith y D. Nathans compartieron el premio Nobel en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción y el desarrollo de sus aplicaciones.

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Existe un grupo de enzimas, las nucleasas, que están especializadas en hidrolizar –cortar- las uniones fosfodiéster que mantienen unidos a los nucleótidos en los ácidos nucleicos. De un modo genérico se denominan DNasas y RNasas, según corten uniones entre nucleótidos de las moléculas de DNA o RNA, respectivamente. Las DNasas se clasifican en enoxucleasas si actúan desde un extremo del DNA (tanto el 3’ como el 5’) y endonucleasas si lo hacen en regiones internas de la molécula. Un tipo particular de endonucleasas son las enzimas de restricción que, por su propiedad de reconocer secuencias específicas de corte, tuvieron especial aplicación en ingeniería genética.

Estudios sobre bacteriófagos mostraron que los virus que infectan una cepa de Escherichia coli en general son incapaces de infectar otra cepa. Se descubrió que esta “restricción” de la infección viral se debe a enzimas que cortan DNA extraño antes de que se replique o se transcriba. Este fenómeno no se circunscribe a E. coli sino que ocurre en una amplia variedad de bacterias. Así, las enzimas de restricción protegen a las bacterias de DNA extraño, ya sea que éste se introduzca por infección de un fago, por conjugación o por transformación.

La característica esencial de las enzimas de restricción es que inciden el DNA solo en secuencias de nucleótidos específicas, por lo general de cuatro a ocho pares de bases. Estas secuencias reciben el nombre de secuencias de reconocimiento.

Vectores para el transporte de secuencias de DNA

Los vectores, también llamados transportadores, permiten introducir el DNA de interés en las células hospedadoras donde se realiza la replicación. Estos vectores deben de cumplir con ciertas características:

- Poseer un origen de replicación que le permita al DNA replicarse en la célula hospedadora.

- Ser de tamaño pequeño para facilitar su aislamiento.

- Contar con sitios únicos de clonado que permitan que una enzima de restricción lo corte en un solo lugar. De esta manera, cuando se inserta un fragmento de DNA, se vuelve a armar el vector, ahora con la nueva secuencia insertada.

- Tener marcadores de selección que permitan verificar su presencia en las células donde se haya introducido. Por lo general, el marcador de selección es un gen que codifica una proteína que le confiere a la bacteria resistencia a un antibiótico. Si las células se colocan en un medio que contiene ese antibiótico, solo las que han incorporado en su DNA los genes de resistencia introducidos sobrevivirán a la acción del antibiótico.

- Los vectores utilizados con más frecuencia son los DNA en forma de plásmidos y los virales.

Clonación

El hacer ADN recombinante en suficientes cantidades para ser útil, requiere de varios pasos.

En el paso 1, se aíslan dos clases de ADN: el plásmido bacteriano que servirá como el vector, y el ADN humano que contiene el gen de la proteína V. En este ejemplo, el ADN que contiene el gen de interés proviene de las células de tejido humano que han crecido en cultivos de laboratorio. El plásmido proviene de la bacteria E. coli.

En el paso 2, se trata tanto al plásmido como al ADN humano con la misma enzima de restricción. Se escoge una enzima para que separe el plásmido en un solo lugar. El ADN humano, con miles de sitios de restricción, es cortado en muchos fragmentos, uno de los cuales transporta el gen de la proteína V. Al hacer los cortes, la enzima de restricción deja disponibles extremos pegajosos,