Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante

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Esos extremos se llaman extremos pegajosos porque se emparejan mediante enlaces de hidrógeno con los extremos de cadenas complementarias, de otras moléculas de ADN que han sido cortadas con la misma enzima. Una vez que los extremos pegajosos de las dos moléculas se han unido de esta manera, entonces se tratan con ADN ligasa, una enzima que une covalentemente a los dos fragmentos de ADN para formar una molécula de ADN recombinante estable.

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Corte de ADN con una enzima de restricción Muchas enzimas de restricción, como la HindIII, cortan el ADN en secuencias que son palindrómicas, produciendo extremos pegajosos complementarios. Las pequeñas fl echas negras designan los sitios de escisión de la enzima.

El ADN recombinante se forma cuando el ADN está empalmado en un vector

En la tecnología del ADN recombinante, los genetistas cortan el ADN que va a ser clonado y el ADN del plásmido mediante la misma enzima de restricción. Entonces las dos muestras de ADN son mezcladas bajo condiciones que faciliten el enlace de hidrógeno entre las bases complementarias de los extremos pegajosos, y las muescas en el ADN recombinante resultante se sellan por el ADN ligasa.

Empalme de ADN ajeno (gen de interés) en un vector de clonación (en este ejemplo, un plásmido bacteriano) para producir ADN recombinante

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Los plásmidos que ahora se utilizan en el trabajo del ADN recombinante han sido extensamente manipulados en el laboratorio para incluir características útiles para aislar y analizar el ADN clonado.

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Entre éstos está un origen de replicación ), uno o más sitios de restricción, y genes que dejen a los investigadores seleccionar células transformadas mediante plásmidos recombinantes. Estos genes permiten que las células transformadas crezcan bajo condiciones específi cas en las cuales las células sin esta modifi cación, no pueden hacerlo. Típicamente, los plásmidos no contienen genes esenciales de las células bacterianas en condiciones normales. Sin embargo, con frecuencia transportan genes que son útiles bajo condiciones ambientales específi cas, como genes que confi eren resistencia a antibióticos particulares o que permiten que las células utilicen un nutriente específi co. Por ejemplo, las células transformadas con un plásmido que incluye un gen para resistencia al antibiótico tetraciclina pueden crecer en un medio que contiene tetraciclina, mientras que ahí las células no transformadas no pueden hacerlo.

Una propiedad limitante de cualquier vector es el tamaño del fragmento de ADN que puede transportar de manera efectiva. Es frecuente que el tamaño de un segmento de ADN se presente en kilobases (kb), con 1 kb igual a 1000 pares de bases. Normalmente, los fragmentos que son más pequeños que 10 kb son insertados en plásmidos para empleo en E. coli. Sin embargo, fragmentos mayores requieren el uso de vectores bacteriófagos, que pueden manejar hasta 23 kb de ADN. Otros vectores son vectores de clonación cósmidos, que son vectores de combinación con características de bacteriófagos y plásmidos, y cromosomas artifi ciales bacteriales (BAC), que acomodan fragmentos mucho más grandes de ADN. Un solo BAC puede incluir hasta 200 kb de ADN extra, una cualidad que hace a los BAC especialmente útiles en el Proyecto Genoma Humano.

El ADN recombinante también se puede introducir en las células de organismos eucariotas. Por ejemplo, los genetistas emplean virus modifi cados como vectores, en células mamarias. Estos virus son desactivados para que no maten a las células que infecten. En su lugar, las moléculas de ADN viral, así como el ADN ajeno que transportan, quedan incorporados en los cromosomas de la célula después de la infección. Posteriormente se analizarán otros métodos que no requieren un vector biológico.

-El ADN puede ser clonado en el interior de las células

Debido a que un gen individual sólo es una pequeña parte del ADN total en un organismo, aislar el pedazo de ADN que contiene ese gen particular es igual a encontrar una aguja en un pajar: se necesita un poderoso detector. Actualmente, muchos métodos permiten a los biólogos aislar una secuencia específi ca de nucleótidos de un organismo. En seguida se presenta el análisis de métodos para clonar el ADN en el interior de las células bacterianas. Como ejemplo se utiliza la clonación del ADN humano, aunque el procedimiento es aplicable para cualquier organismo.

El ADN total en una célula constituye su genoma. Por ejemplo, si el ADN se extrae de las células humanas, entonces se conoce como ADN genómico humano. Una biblioteca de ADN genómico es una colección de miles de fragmentos de ADN que representan a todo el ADN en el genoma. Cada uno de estos fragmentos se puede insertar en un plásmido, que a su vez normalmente se incorpora en una célula bacteriana. Así, una biblioteca de ADN genómico está almacenada en una colección de bacterias recombinantes, cada una con un diferente fragmento de ADN humano. Los científi cos emplean bibliotecas de ADN genómico para aislar y estudiar genes específi cos. Además, las bibliotecas de ADN genómico contienen un gran número de secuencias de bases que no codifi can proteínas.

Los cromosomas individuales también se pueden aislar para elaborar una biblioteca cromosómica que contiene todos los fragmentos de ADN en ese cromosoma específi co. Si se conoce que un gen de interés está asociado con un cromosoma particular, entonces es más fácil aislar ese gen de una biblioteca cromosómica que de la biblioteca de ADN genómico. Los métodos de clonación básicos apenas descritos se utilizan para elaborar ADN genómico o bibliotecas cromosómicas. Primero, el ADN se corta con una enzima de restricción, generando una población de fragmentos de ADN

Producción de una biblioteca de ADN genómico o una biblioteca cromosómica

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Esos fragmentos varían en tamaño y en la información genética que transportan, pero todos ellos tienen extremos pegajosos idénticos. Los genetistas tratan al plásmido de ADN, que será empleado como un vector, con la misma enzima de restricción que convierte los plásmidos circulares en moléculas lineales con extremos pegajosos complementarios a aquellos de los fragmentos de ADN humano. Los plásmidos recombinantes se producen mezclando los dos tipos de ADN (humano y plásmido)

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