CRIMINOLOGÍA, CRIMINALÍSTICA Y TÉCNICAS PERICIALES.

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MATERIAL NECESARIO PARA LA PRÁCTICA.

PAQUETE Biotechnology Explorer™

Forensic DNA Fingerprinting Kit™ DE LA MARCA COMERCIAL BIORAD™

Sistema de electroforesis en gel de agarosa1❑

Gel de agarosa1❑

Muestras de ADN digeridas, obtenidas en la práctica 2, (6)❑

Muestras de ADN amplificadas, obtenidas en práctica 4

Gradilla para tubos demicro-centrífuga1❑

Gradilla para tubos de PCR

Tinte muestra de ADN de carga 1❑

Marcador permanente1❑

Puntas de pipeta, 2-20µl (microlitros) 13❑

Micropipeta ajustable, 2-20µl 1❑

Película de soporte del gel(si corresponde) 1❑

Charola de tinción (si aplica) *1❑

Espuma microsoporte de tubos de ensayo1❑

Fuente de poder BIORAD™ 1❑

Bandeja de tinción del gel de1 por2estaciones❑

Tampón de electroforesis(TAE 1x) 275ml por ❑estación

Estación de trabajo común

material

Microcentrífuga BIORAD™1❑

o minicentrífuga(opcional) 4❑

Baño María 1❑

Matraz erlenmeyerde200ml1❑

PROCEDIMIENTOS DE LA PRÁCTICA DE ELECTROFORESIS

1.- PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA.

La concentración de agaros a recomendada para geles en esta aplicación es el 1%.Esta concentración proporciona buena resolución y minimiza el tiempo de ejecución requerido para la separación electroforética de fragmentos de ADN.

El espesor recomendado para el gel es 0,75 a 1,0cmpara facilitar la muestra carga y manipulación del gel. Asegúrese de usar búfer (tampón) TAE(Tris-acetato-EDTA)de electroforesis para preparar el gel de agarosa.

2.-Preparaciónde agarosa. Para hacer una solución de agarosa al1%, usar1gramo de agarosa por cada100ml debúfer1xTAEde electro foresis ¡Asegúrese de usar tampón de electroforesis, no agua! Para un gel de 7 x 7 cm, se requieren 40 ml de preparación de agarosa

3.- Se requiere un peine de 8 dientes para hacer los pocillos en el gel, donde será cargado el ADN obtenido previamente de la práctica número 2.

4.- Se colocará otro peine para hacer los pocillos en el gel donde será cargada la amplificación obtenida previamente en la práctica 4.

INSTRUCCIONES:

Añadir el polvo de agarosa a un recipiente adecuado (por ejemplo, un matraz Erlenmeyer de 200ml). Añadirla cantidad apropiada de tampón de electroforesis TAE 1xy agitar para suspender el polvo de agarosa en el tampón. La agarosa puede ser derretida para la fundición hirviéndola hasta que se derrita por completo en una placa térmica o baño María. ¡Este proceso debe hacerse con cuidado!

Precaución:

Siempre use guantes de protección, gafas y bata de laboratorio, para la preparación de geles de agarosa.

Método del horno de microondas.

Esta técnica es la forma más rápida y segura para disolver agarosa .Coloque la solución de gel en una botella o frasco adecuado en el microondas ponga en funcionamiento al horno durante 3 minutos. Detenga el horno de microondas cada 30segundos y, utilizando guantes protectores, agitar el matraz para suspender cualquier agarosa disuelta.

Caliente y revuelva la solución hasta que todas las pequeñas partículas de agarosa transparentes se disuelven.

Ponga a un lado y deje que se enfríe (55-60 °C) antes de verter.

- Vierta suficiente de agarosa para cubrirlos dientes del peine de gel a una profundidad de0,5-0,75cm. No mueva ni maneje la bandeja de gel hasta que el gel se ha solidificado.

- Nivelar la bandeja de gel utilizando el nivel de burbujas suministrado con la cámara electroforética. Enfriar la agarosa a por lo menos 55-60° Cantes de verter.

- Coloque el peine en la ranura correspondiente de la bandeja de gel.

- Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante10 a 20 minutos. El gel se verá opaco cuando esté listo para usar.

- Retire con cuidado el peine del gel solidificado.(En este momento, el gel puede refrigerarse para su posterior uso).

- Coloque el gel en la cámara de electroforesis de ADN de manera que los pocillos están en el lado negro (cátodo) de la cámara electroforética. Las muestras de ADN migrarán hacia el (ánodo) extremo rojo de la cámara durante la electroforesis.

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LLEVANDO A CABO LA ELECTROFORESIS.

1. Saque las muestras de ADN digerido previamente en la práctica 2 del congelador, descongele las muestras y golpeé ligeramente para que el líquido de los tubos Digerido de ADN) quede en la parte inferior. Repita el procedimiento para las muestras amplificadas de la práctica 4.

2. Usando una puntilla diferente para cada muestra, añadir 5 µl de colorante de carga "LD" en cada tubo .Taparlos tubos y mezclar suavemente agitándolo. Precipita la muestra en el parte inferior del tubo golpeándolo suavemente sobre la mesa.

[pic 9]

3.- Con el gel de agarosa en la cámara electroforética. Llene la cámara de electroforesis con búfer TAE 1x*para cubrir el gel, utilizandoaproximadamente275ml.

[pic 10]

4. Compruebe que los pozos de los geles de a garosa están cerca del electrodo negro y la parte inferior.

[pic 11]

7. Usando una punta diferente para cada muestra, carga 5 µlen los pocillos del gel en el siguiente orden: