Cromatografía líquida. Tipos de cromatografía

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Aplicaciones

Campo de aplicación de la cromatografía de líquidos de alta resolución:

Esta se considera como la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada, las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero más importante, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad.

Algunos ejemplos de estos materiales son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

Cromatografía de reparto

Cuando se utilizan rellenos unidos químicamente en fase inversa junto con los solventes muy polares se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografía de líquidos. Esta tiene una gran conveniencia ya que tiene la facilidad de modificar k y Alpha al variar las fases móviles acuosas, estos rellenos se aplican con frecuencia antes que todos los otros en el caso de separaciones de exploración con nuevos tipos de muestra.

Formación de derivados: En ocasiones, la mejor opción es convertir los componentes de una muestra a un derivado antes o (en algunos casos) después de la separación cromatográfica. Tal tratamiento puede ser deseable por varias razones, como para reducir la polaridad de la especie y poder utilizar la división de columnas más que la adsorción o intercambio de iones, para aumentar la respuesta del detector y así la sensibilidad para todos los componentes de la muestra, y para realzar selectivamente el detector a ciertos componentes de la muestra.

Aquí se pueden ver los campos de aplicaciones y las mezclas características de cada uno.

- Fármacos: Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos.

- Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.

- Productos alimenticios: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos.

- Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes.

- Contaminantes: Plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados.

- Ciencias forenses: Fármacos, venenosos, alcohol en sangre, narcóticos.

- Química clínica: Ácidos biliares, metabolitos de fármacos, extractos de orina, estrógenos.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Antes que todo, debemos destacar que los métodos de filtración sobre gel y el de penetración sobre gel son complementarios porque el primero se aplica a muestras solubles en agua y la segunda para sustancias en solventes orgánicos menos polares.

Una de las aplicaciones más útiles de este procedimiento es la separación de las moléculas de elevada masa molecular, de productos naturales de las especies de baja masa molecular y de las sales. Un buen ejemplo es que un gel con un límite de exclusión de varios miles puede separar con claridad las proteínas de los aminoácidos y de los péptidos de baja masa molecular. Otra aplicación útil de esta es la separación de homólogos y oligómeros.

Esta también se utiliza para la determinación rápida de las masas moleculares o en la distribución de masas moleculares en los grandes polímeros o productos naturales. La clave de tales determinaciones es una calibración exacta de la masa molecular, esta calibración se puede conseguir mediante patrones de masa molecular conocida o por el método de calibración universal, este último se basa en el principio de que el producto de la viscosidad molecular intrínseca n y la masa molecular M es proporcional al volumen hidrodinámico, las moléculas se separan de acuerdo con el volumen hidrodinámico, por lo que una curva de calibración universal se obtiene de graficar log(nM) contra el volumen de retención.

Entra las ventajas más importantes de este método están: tiempos de separación cortos y muy bien definidos, bandas estrechas que ocasionan buena sensibilidad, no hay perdida de muestra porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria y no se desactiva la columna por la interacción del soluto con el relleno. Las desventajas son que solo una cantidad limitada de bandas se pueden acomodar porque la escala de tiempo del cromatograma es corta, y la inaplicabilidad con muestras de dimensiones similares, como los isómeros, se requiere una diferencia de un 10% en las masas moleculares para obtener una resolución razonable.

Instrumentos para cromatografía de líquidos

Para lograr flujos razonables con rellenos de tamaño de partículas de entre 3 y 10 micrómetros, se requieren presiones de bombeo de varios cientos de atmósferas. Debido a estas presiones elevadas, el equipo necesario para la cromatografía de los líquidos de alta resolución tiende a ser más complejo y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía.

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Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento del solvente

Un aparato moderno para cromatografía de líquidos está equipado con uno o más recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 ml o más de un solvente. A menudo están equipados con un sistema para eliminar los gases disueltos y el polvo de los líquidos. Los gases disueltos ocasionan flujos inestables y ensanchamiento de bandas; además, las burbujas y el polvo interfieren con el funcionamiento de la mayoría de los detectores.

Los desgasificadores pueden consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, un dispositivo para calentar y agitar los solventes, o bien pueden estar compuestos por sistemas de purgas que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante burbujas de un gas inerte insoluble en la fase móvil.

Una elución que utiliza un solo solvente o una mezcla de solventes de composición constante se denomina elución isocrática. En la elución con gradiente se usan dos sistemas de solventes y algunas veces más, que difieren de manera notable en cuanto a polaridad y varían en composición durante la separación.

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