Cuantificación de ADN por espectrofotometría

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DISCUSIÓN:

El espectrofotómetro se fundamenta en la transmisión de la luz a través de una solución.

Cada molécula absorbe la energía a una longitud de onda específica, a partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en una solución. La ley de Lambert-Beer establece que existe una relación lineal entre la absorbancia A (también denominada densidad óptica, DO) y la concentración de la macromolécula, conforme a la ecuación siguiente:

A = DO = εlc

Donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de luz de la cubeta.

Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. La absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm.

Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos.

Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a:

50 µg/ml de ADN bicatenario o 50 ng/µl de ADN.

En este caso se obtuvo 0.96 de absorbancia, y haciendo la relación correspondiente se obtuvieron 48 ng/µl de ADN contenido en la muestra.

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