Extracción de ADN Rotura Celular

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Esto ahorra tiempo y limita la perdida de DNA. Esto se puede hacer mediante la eliminación de enzimáticamente mayoría de la proteína antes de extracción. Otra modificación de uso frecuente es la combinación de fenol y cloroformo (extracción en un solo paso).

El uso eficiente de los métodos de Kirby y MARMUR de desproteinización

de DNA requiere la digestión enzimática previa de proteínas. Estos métodos pueden

ser utilizados sin este paso preliminar cuando existen pequeñas cantidades de proteína en la solución de DNA.

DESPROTEINIZACION USANDO ENZIMAS

Las enzimas pueden ser eliminadas usando proteasas que pueden digerir todas las proteínas. Dos enzimas usadas son la proteinasa K y pronasa. Ambas enzimas son estables, especificidad general de proteasas que son secretadas por hongos. Las preparaciones comerciales de estas enzimas son baratas y libres de contaminación por DNAsas lo que las hace seguras para la purificación de ácidos nucleicos. Las proteasas son activadas en la presencia de bajas concentraciones de detergentes aniónicos. Altas concentraciones de sales y EDTA; exposición a un amplio pH (6.0-10.0) y temperatura optima (50-67°C). Estas pueden digerir intactas (estructura globular) y desnaturalizando (cadenas de polipéptidos) las proteínas y ni requieren de ningún cofactor. La Proteinasa K y pronasa se utilizan generalmente en los procesos de purificación del DNA a concentraciones finales de 0.1-0.8 mg-1. La diferencia entre estas dos enzimas está en las actividades dirigidas hacia sí misma; la pronasa es una enzima de autodigestion, mientras que la Proteinasa K no. El hecho de que la Proteinasa K no sea una enzima de autodigestion hace que sea más conveniente de usa que la pronasa, ya que es innecesario añadirla continuamente durante el curso de la reacción.

El principal inconveniente en el uso de estas enzimas es que el tratamiento enzimático solo puede quitar del 80 al 90% de las proteínas presentes. Esto se debe a que la digestión de la enzima es una reacción enzimática que es dependiente del sustrato y de la concentración de la enzima. En la práctica, la tasa de desproteinización depende solamente de la concentración de proteínas (sustrato), debido a que no resulta práctico añadir una gran cantidad de enzima para acelerar una reacción con una baja concentración de sustrato. Por lo tanto ya que la reacción se desarrolla de la concentración de sustrato disminuyendo progresivamente, con lo que se ralentiza la velocidad de concentración y, de hecho, las reacciones enzimáticas se finalizaran a un tiempo infinito. A altas concentraciones de sustrato y a concentraciones suficientes de enzima, la reacción transcurre a una velocidad máxima hasta que el 80 a 90% del sustrato se ha eliminado. Entonces la velocidad de reacción se vuelve demasiado lenta para ser práctico para la eliminación de proteínas restantes a un tiempo razonable.

Las características de la eliminación enzimática de proteínas hechas por una desproteinización enzimática es un primer paso ideal e indispensable en la purificación de ácidos nucleicos. Este tratamiento se utiliza cuando está presente una gran cantidad de proteínas, es decir, justo después de la lisis celular. Las proteínas restantes se pueden eliminar con un disolvente orgánico.

LA ELIMINACION DEL RNA

La eliminación de ARN a partir de preparaciones de ADN se lleva a cabo generalmente usando un procedimiento enzimático. En consecuencia, este procedimiento no elimina todo el ARN y, por lo tanto, proporciona preparaciones de ADN con una muy pequeña cantidad de contaminación de ARN. Se utilizan dos ribonucleasas que pueden ser fácil y económicamente preparados libres de contaminación DNasa, a saber, ribonucleasa A y ribonucleasa T1.

La ribonucleasa (Rnasa A) es una endorribonucleasa que segmenta el RNA después de residuos de C y U. La reacción genera 2,3-fosfato cíclico que es hidrolizado a nucleósido 3-fosfato con la produciendo oligonucleótidos con terminación de nucleótidos de pirimidina 3-fosforilados.

La Ribonucleasa T1 (RNasa T1) es una endorribonucleasa que es muy similar a la RNasa A en sus condiciones de reacción y estabilidad. La enzima segmenta el RNA bicatenario y monocatenario después de residuos de G, generando oligonucleótidos con terminación en un nucleótido de guanina 3-fosforilado.

Debido a la especifidad de estas enzimas para segmentar el ARN, se recomienda que sean usadas juntas para el retiro completo del RNA de muestras de ADN. El uso de solamente una de estas enzimas puede resultar en contaminación de preparaciones de ADN con una gran cantidad de oligonucleótidos que hará prácticamente imposible la medición espectrofotométrica de la concentración de ADN.

Concentrando el DNA

La precipitación con alcohol se realiza generalmente para la concentración de ADN a partir de la fase acuosa de la etapa de desproteinización. Dos alcoholes se usan para la precipitación de ADN: el etanol y el isopropanol. La precipitación con alcohol se basa en el fenómeno de disminución de la solubilidad de los ácidos nucleicos en agua. Las moléculas de agua polares rodean las moléculas de ADN en soluciones acuosas. Los dipolos cargados positivamente de agua interaccionan fuertemente con las cargas negativas sobre los grupos fosfodiéster del ADN. Esta interacción promueve la solubilidad de ADN en agua. El etanol es completamente miscible con agua, sin embargo, es mucho menos polar que el agua. Las moléculas de etanol no pueden interactuar con los grupos polares de ácidos nucleicos con tanta fuerza como el agua, el etanol es un solvente muy pobre para los ácidos nucleicos.

Un remplazo en el 95% de las moléculas de agua en una solución de ADN hará que precipite. La realización de una solución de ADN de 95 por ciento de etanol no es práctico, ya que requiere la adición de un gran volumen de etanol 100%. Para precipitar el ADN a una concentración menor de etanol, la actividad de las moléculas de agua se debe disminuir. Esto se puede lograr mediante la adición de sales a las soluciones de ADN. Por otra parte, la presencia de sales cambiará el grado de neutralización de la carga de los fosfatos del ADN, provocando grandes cambios en las propiedades hidrodinámicas de las moléculas de ADN (Eickbush y Moudrianakis, 1978). Estos cambios, simultáneamente con la eliminación de agua, harán que la separación de la fase de ADN, es decir, la precipitación, en el momento de la completa neutralización de moléculas de ADN.

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