Cuantificación de RNA y DNA

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CÁLCULOS

Cálculo del Radio

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Cálculo de x en (ug/uL)

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Cálculo de u L

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- DISCUSION.

La cuantificación de ADN la realizamos a través de la espectrofotometría con la medición de las absorbancias de 260 y 280 nm, de longitud de onda. (Hueros, Gómez, & Sanz, 2007), menciona que tanto el DNA como RNA absorben luz ultravioleta a una longitud de onda entre 250 y 270 nm debido a los espectros característicos de sus bases nitrogenadas las bases púrica y pirimidinicas y esqueleto de azúcar-fosfato no contribuye a la absorbancia, además en (Puerta & Pinzon, 2005) mencionan que estas bases tienen la capacidad de absorber la luz uv y explica que una unidad de densidad óptica a 260 mn equivale a ug/ml de ADN de doble cadena, a 40 ug/ml de ARN y ADN, y a 2º ug/ml de oligonucleótidos;

(Giraldo, Loango, & Mejia, 2010), también explica que las proteínas tiene una capacidad de absorbancia de 280 nm y la máxima absorbancia de las proteínas está dada a una longitud de onda 280 nm. Explica que la pureza se determina utilizando la relación de absorbancias ADN/proteínas y que esta debe oscilar en un rango de 1,8 a 2, si es una muestra pura; esto va acorde a lo que hicimos en nuestra practica debido a que no sometimos a estos parámetros sin embargo los resultados de pureza que se obtuvieron ni se acercaban a estos valores, esto ocurren debido a que existe más proteínas que ADN por este motivo la A280 es mayor que la A260 y al realizar la relación esta tiende a el valor 0. (Giraldo, Loango, & Mejia, 2010).

Existen varios factores que perturban a las medicines de absorbancia en un espectrofotómetro. Una de estas es el material de la celda de muestra para la práctica que realizamos se manejó material de plástico las cuales deben ser utilizadas para rangos de 400 – 1100 nm, la calidad de estas celdas varía, de acuerdo a que absorben significantemente y la variación de longitud interna, cuando lo óptimo es de 1 cm; de esto depende el paso de luz para una correcta medición. (Arenas Sosa & López Sánchez, 2004)

Para la medición de la absorbancia debemos recordar primero hacer la medición del blanco para eliminar la absorbancia extra del disolvente que vamos a usar, porque posee una diferencia de analitos con respecto a la muestra, También se da este problema si no se ha extraído con cuidado la muestra, puede ser causa de amasarla bien en el mortero con el pistilo, que corresponden a la fase de extracción. (Agilent Technologies, Inc., 2003)

Para todas las muestras con los valores de la relación A260/A280 que obtuvimos fueron menores a 1.8 lo que indica contaminación de proteínas se recomienda ser sometidas a la incorporación de la proteína de digestión K. según. Mientas que se recomienda lavados de la muestra por precipitación con etanol y resuspesión del DNA con TE cuando se tiene muestras con valores de la relación A260/A280 son mayores a 2 (Held, 2010)

- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

- Un rango adecuado de la relación de la absorbancia 260/280, es 1.8 – 2, ya que dentro de estas magnitudes se descarta riesgo de una contaminación biológica o química.

- Cuando el rango de absorbancia es menor a 1.8, se concluye que se tiene en la muestra una contaminación biológica, y la cual se puede corregir purificando la muestra con RNAasa o con lavados con agua normal.

- Cuando el rango de absorbancia es mayor a 2, se concluye que se tiene en la muestra una contaminación química, y la cual se puede corregir a través de lavados con etanol, o en otros casos se debe realizar otro método de extracción de AND.

- Los datos obtenidos de absorbancia en el espectrofotómetro, depende del método de extracción de ADN ya que si este es realizado inadecuadamente, los resultados obtenidos al medir la absorbancia serán incorrectos.

- Es recomendable adquirir nuevos equipos, en especial, un nuevo espectrofotómetro para realizar correctamente la medición de absorbancia de las disoluciones de las muestras.

- BIBLIOGRAFIA

Biología Molecular. (s.f.). Recuperado el 26 de 07 de 2016, de Cuantificación de Ácidos Nucleicos: https://biologiamolecularinteractiva.wordpress.com/about/cuantificacion-de-acidos-nucleicos/

Agilent Technologies, Inc. (2003). Agilent 8453 Sistema de Espectroscopía UV-visible: Guía de Usuario. Alemania.

Andina, b.-l. (03 de Enero de 2015). bio-lab Andina. Obtenido de bio-lab Andina: http://www.biolabandina.com/index.php/extraccion-de-dna/dnazol/dnazol-100-ml-detail

Arenas Sosa, I., & López Sánchez, J. L. (2004). Espectrofotometría de Absorción. Cuernavaca: Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

Giraldo, G., Loango, N., & Mejia, C. (2010). Laboratorio de Bioquímica: Una visión práctica. Quindio: Universidad del Quindio.

González, F. (2006). Ensayos médicos sobre genética : la genética molecular en la medicina ecuatoriana. Quito: [Quito, Ecuador] .

Held, P. (2010). BioTek. Obtenido de Tech Resources: http://www.biotek.com/resources/articles/nucleic-acid-purity-a260a280.html

Hotzel, H., Muller, W., & Sach, K. (2009). Recovery and characterization of residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified ingredients. European Food R3esearch Tecnology.

Hueros, G., Gómez, E., & Sanz, Y. (2007). Prácticas de Biología Molecular. Obtenido de https://portal.uah.es/portal/page/portal/GP_EPD/PG-MA-ASIG/PG-ASIG- 65315/TAB42351/Pr%E1cticas%20molecular%202008.pdf

Puerta, C., & Pinzon, C. (2005). Practicas de biologia molecular. Bogota: Pontificia Universidad Javeriana.

Somma, A. (2007). Extracción y Purificación de ADN. Institute for Health and Consumer Protection, 10-11.

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