“DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE UNA PROTEÍNA USANDO CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR”.

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[pic 4]

Tabla 3. Relación de Ve/Vo y el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrón y problema.

Proteínas

Vo (mL)

Ve (mL)

Ve/Vo

PM (g/mol)

Log PM

Hemoglobina

18

18

1.0

64500

4.809

Peroxidasa

18

24

1.33

44050

4.643

Tripsina

18

27

1.5

24000

4.380

Lisozima

18

27

1.5

14400

4.158

Problema

18

24

1.33

¿?

-

[pic 5]

De acuerdo a la ecuación de la recta establecida en la figura anterior se interpola el valor para la proteína problema.

De la ecuación de la recta y= mx + b

Se tiene que: y= Ve/Vo x= log PM

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[pic 7]

[pic 8]

[pic 9]

Discusión.

Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rápidamente en lo que se denomina “volumen vacío” de la columna y se dicen que son excluidos del gel. 3

De acuerdo a la definición anterior se determinó el volumen vacío de nuestra columna, dicho volumen se determinó gracias al azul de dextrana 2000 que tiene un peso molecular de 2, 000,000 g/mol. 4 se utiliza la dextrana ya que es una molécula muy grande y de acuerdo al principio de separación es excluida por el gel rápidamente. De acuerdo al perfil de elución obtenido se toma en cuenta que el punto donde se obtiene la máxima absorbancia es nuestro volumen vacío ya que ahí se asegura que existe la mayor concentración de dextrana.

De acuerdo a la figura 2 donde se hizo un perfil de elución de las proteínas se observa como fue el orden en que eluyeron, y según dicho orden se puede asegurar que fue el esperado ya que en primer lugar eluyó la hemoglobina cuya masa molar es mayor que las demás y de acuerdo al principio de separación las de mayor tamaño son aquellas que se eluiran más rápido que las más pequeñas ya que estas últimas pueden entrar más fácilmente en los poros del gel por lo que se retienen, por esto la lisozima por ejemplo es la que tiene un mayor tiempo de retención y por ende un mayor volumen de elución pero en la figura se muestra que tanto la lisozima como la tripsina y la peroxidasa tienen casi el mismo volumen de elución, este hecho puede deberse factores como el ancho de la columna, las burbujas en la fase estacionaria, la altura de esta, la longitud del lecho cromatografico y el tiempo de interacción, que afectan de cierta manera la separación. Alguno de estos factores podría haber intervenido para que los volúmenes de elución fueran muy parecidos.

Por otro lado el peso molecular de la muestra problema obtenido fue de y de acuerdo a la molécula que se tenía el peso molecular de la pepsina que era nuestra molécula problema tiene un peso molecular de 34500 g/mol. Existe una significativa diferencia entre lo esperado y lo obtenido. Y de acuerdo al perfil de elución elaborado se tiene que la muestra problema tiene el mismo volumen de elución que la lisozima y la tripsina cuando lo esperado es que la pepsina eluyera en primera instancia, enseguida la tripsina y posteriormente la lisozima que tienen de mayor a menor peso molecular respectivamente, esto se debe principalmente a que la elución se ve afectada por la geometría de las columnas utilizadas ya que se llevó a cabo la separación en columnas diferente. 5[pic 10]

El peso obtenido de la molécula problema según la interpolación fue más bajo que el esperado esto se obtuvo mediante el volumen de elución relativo (Ve/Vo), el cual indica la parte del volumen en el interior de los poros al que puede acceder cada molécula dependiendo claro de su tamaño, y con ello no depende de la geometría de la columna. Con este volumen de elución relativo se realiza una curva de calibración que tiene pendiente negativa lo cual indica que a mayor peso molecular, menor volumen de elución.

En relación a esta curva de calibración (figura 3) es importante mencionar que se obtuvo un coeficiente de correlación muy bajo y esto se debe a factores ya mencionados como por ejemplo el empaquetamiento de la columna y la formación de burbujas en este que no permitiría una buena elución o quizá a la velocidad de elución ya que al aumentarla la resolución disminuye porque no existe una buena interacción entre el analito y la fase estacionaria, además podría afectar la altura del lecho cromatografico y con ello la cantidad de platos teóricos ya que si hay pocos se tiene una pobre resolución. Además si la columna estaba sucia pudo haber ocasionado que el gel se compactara demasiado sin permitir así una buena elución.

Preguntas extra:

- Mencione dos métodos para determinar el peso molecular.

El método de Víctor Meyer emplea un tubo de vidrio largo con dos tubuladuras laterales en la parte superior, una para recoger el aire desplazado en una campana de gases y otra provista de una varilla