EL LABORATORIO DE EMBRIOLOGÍA

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– Concentración de SPZs a inseminar: 50000-250000 (100000) por ovocito.

– Inseminaremos varios ovocitos juntos (en placas de 4 pocillos) o bien separados uno

a uno (en microgotas).

– Tiempo de espera para inseminar: 2-6 h tras punción

– Tiempo de inseminación: 16-18hLa ICSI difiere fundamentalmente de la FIV en que se selecciona un SPZ (con mejor morfología y movilidad) y se microinyecta en un ovocito. Este ovocito debe ser primero decumulado (liberado de las células de la granulosa) para así poder visualizar al microscopio su grado de madurez nuclear (valoración de los ovocitos) y segundo microinyectado.

Los materiales y medios necesarios son: placas de 4 pocillos, placas de cultivo en microgotas, placas de microinyección (ICSI), medio de cultivo para lavado de gametos y medio de cultivo para FIV, incubador a 37ºC y 5-6 % CO2, pipetas pasteur estiradas a la llama, microscopio invertido con sistema de micromanipulación adaptado. 1º Decumulación de los ovocitos: se prepara placa de 4 pocillos disponiendo en pocillo 1: hialuronidasa diluida con medio cultivo, pocillos 2,3 y 4 medio cultivo. Los cúmulos que son ricos en ácido hialurónico se pasan al primer pocillo con hialuronidasa mediante una pipeta Pasteur flameada unida a mecanismo de succión manual y, aspirándolos y expulsándolos varias veces se decumula groseramente. En esta solución no deben estar más de un minuto. Luego se pasan los ovocitos al segundo pocillo con medio de cultivo para lavarlos de la hialuronidasa y de aquí al tercer pocillo, en donde los ovocitos están rodeados todavía por algunas células de la granulosa que se irán eliminando mecánicamente con sucesivos pases por pipetas Pasteur estiradas a la llama de diferentes calibres. Una vez eliminadas todas las células de la granulosa, los ovocitos se pasan al cuarto pocillo donde se procederá a su clasificación: (Figura 3)

• Vesícula germinal (VG): ovocitos oscuros que se encuentran en profase de la primera división meiótica, se identifica claramente un núcleo en dictiotene llamado vesícula germinal.

• M I: son ovocitos inmaduros que se encuentran en estadio de metafase de la primera división meiótica. No se ha extruido todavía el primer corpúsculo polar.

• Atrésicos o degenerados: ovocitos deformes, oscuros y sin membrana citoplasmática claramente definida.

• M - II: ovocitos en estado preovulatorio que se encuentran en el estadio de metafase de la segunda división meiótica y en los que se observa claramente el corpúsculo polar. Los ovocitos M- II son los se consideran aptos para la microinyección.

2º Microinyección de los ovocitos: una vez se tienen los ovocitos decumulados y los espermatozoides capacitados, se procede a realizar la microinyección. Los pasos a seguir son los siguientes:

– Colocación y alineación de las pipetas en microscopio invertido: se utilizan dos pipetas, una de sujeción o HOLDING y otra de microinyección o ICSI.

– Preparación de la placa de microinyección ( placa de ICSI): en esta placa se ponen dos gotas de 5 μl de PVP (polivinilpirrolidona). A la derecha de estas y haciendo una fila se ponen gotas de 5 μl de medio de cultivo tamponado, tantas como ovocitos se vayan a microinyectar. Se cubren todas las gotas con aceite mineral. – En la placa de ICSI se colocan los ovocitos en las gotas de medio y los espermatozoides en una de las dos gotas de PVP. Se lleva la placa así preparada al microscopio invertido con platina calefactada. Se bajan las pipetas y se aspira una pequeña cantidad de PVP.

– Se busca, captura e inmoviliza un espermatozoide: para ello se introduce la pipeta de microinyección en la gota de PVP limpia y se aspira un pequeño volumen de medio. Se pasa a la gota de PVP con espermatozoides, seleccionar uno con morfología normal e inmovilizarlo mediante un golpe en la cola con la pipeta de ICSI. Se inmovilizan los espermatozoides para evitar que el movimiento del flagelo dañe las estructuras celulares del ovocito y para facilitar la fecundación, ya que con la desestructuración de la membrana del espermatozoide se facilita la descondensación del núcleo de éste y la posterior formación del pronúcleo masculino.

– Se aspira el espermatozoide inmóvil con la pipeta de ICSI preferiblemente por la cola, se aspira con la HOLDING el ovocito y se coloca con el corpúsculo polar en posición de las 6 ó las 12 horarias (para evitar dañar el huso meiótico que suele estar en la porción del citoplasma adyacente al corpúsculo).

– Se acerca la pipeta de ICSI a la zona pelúcida por la zona de las 3 y se aproxima el espermatozoide a la punta de la pipeta. Se presiona el ovocito con la pipeta hasta atravesar la zona pelúcida y se aspira una pequeña cantidad de citoplasma para confirmar que la membrana se ha roto. Se deposita el espermatozoide en el interior del citoplasma del ovocito y se retira la ICSI con suavidad.

Una vez se ha finalizado la microinyección se pasan los ovocitos a placas con medio de cultivo para FIV (medio para desarrollo embrionario desde d+0 hasta d+1) que previamente han sido equilibradas en el incubador.