ENSAYOS ENZIMÁTICOS

...

El pH de una mezcla amortiguadora se puede conocer mediante la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

pH =pKa- log [HAc]/[Ac-]

SOLVENTES

El solvente mas utilizado es el agua, sin embargo en casos especiales como para enzimas que están conectadas a la membrana se usan solventes orgánicos apolares. Esto para desnaturalizar a las enzimas. La relación del disolvente orgánico en la mezcla de ensayo está directamente conectada con la concentración del compuesto débilmente soluble y a veces deben aceptarse concentraciones inferiores a las requeridas. Bisswanger Consideró que la solubilidad depende fuertemente de la temperatura, El compuesto puede ser solo soluble a la temperatura del ensayo, pero puede precipitarse si la mezcla de ensayo se mantiene en frío antes de la prueba, por lo tanto para hacer comparaciones de diferentes ensayos es necesario mantener constante el volumen del solvente orgánico

Temperatura:

Incremento de la velocidad con la temperatura: En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de transición, para formar a los productos.

Decremento de la velocidad con la temperatura: la elevación excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las enzimas.

Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 °C; la temperatura media del organismo del ser humano es 37 °C. Así, las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a partir de los 40 °C. En cambio, las enzimas de las arqueas termófilas, que se encuentran en manantiales calientes, son estables hasta a 100 °C.5 Sin embargo, la idea de de una velocidad "óptima" para una reacción enzimática es engañosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. Si se usase un ensayo para medir esta segunda actividad por segundo, la velocidad sería alta a altas temperaturas, y usando un ensayo para cuantificar la formación de producto ésta sería baja a esas temperaturas.

Debido a que las enzimas aceptan diferentes sustratos y a su eficiencia en la variación catalítica, los resultados obtenidos para la misma enzima con diferentes sustratos no pueden ser comparados. La eficiencia de un sustrato se determina por su valor de Km, cuanto menor es este valor, mejor es el sustrato. Normalmente se puede tomar el sustrato más eficiente, pero también se deben considerar otros aspectos, como la disponibilidad, estabilidad, solubilidad y accesibilidad a un método de detección.

La preparación depende del tipo de ensayo enzimático ya que la mayoría ocupan varios compuestos como diferentes sustratos, cofactores, activadores. Se debe tomar en cuenta que en los procedimientos debemos reducir todos los pasos donde se pueda cometer algún error por falta de precsión como “pipetear” pequeños volúmenes, por lo que se recomienda prepara volúmenes mayores y dividirlo en porciones que se pueden congelar para evitar que se contaminen y debemos asegurarnos que todos los compuestos que utilicemos no reaccionen entre si.

Para llevar a cabo el ensayo enzimático primero debemos transferir una alícuota de la mezcla de ensayo a un recipiente de observación, asegurándose que éste se pueda calentar, y para dar inicio a la reacción se agrega el ultimo componente que hacía falta y es crucial estar atento a la agitación la cual debe ser rápida para asegurar una distribución homogénea y no perder información.

Cualquier ensayo enzimático necesita un blanco 30 si es un ensayo discontinuo es obligatorio este blanco para relacionar al obtener la velocidad de reacción, e cambio si es un ensayo continuo no es necesario, pero si se ocupa para calibrar nuestro instrumento a cero. En caso de que se use la mezcla de ensayo como blanco debemos asegurarnos que el componente que va a iniciar la reacción no transofrme el blanco ya que al hacer el ensayo los resultados caerán fuera del rango de operación.