El descubrimiento de técnicas de recombinación de ADN de plantas

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2.2. Construcción intragénica La construcción intragénica generó un casete lineal de 2827 pb compuesto por la secuencia promotora (969 pb) de la enzima Rubisco (Rco) de subunidad pequeña codificada por ZmRBSC-m3 en el maíz, seguida por la secuencia codificante del gen ZmRca, con su propia Peptidesignal para la entrada de cloroplastos (1302 pb) (número de acceso AAG22094.3) (Ayala-Ochoa et al., 2004) y la secuencia terminadora (488 pb) de la misma fuente que el promotor (Schäffner y Sheen, 1991; Viret et al. ., 1994). Además, el casete intragénico contenía 68 pb que corresponden a sitios de enzimas de restricción para facilitar el clonaje y la purificación. Estos sitios se establecieron entre los extremos de las tres secuencias. El casete se sintetizó y subclonó usando GenScript USA (Piscataway, NJ, USA) en el plásmido puc 57 (5530 pb, PM = 3.594.500 g / mol). Este plásmido se replicó en células de E. coli. El casete intragénico se aisló del plásmido puc 57 antes del bombardeo (1 \ mu g / \ mu l) usando reacciones de digestión con PstI y DraI para eliminar las fracciones de plásmido que no son necesarias para la planta.

2.3. La transformación del maız con constructo intragénico Los callos embriogénicos de maız se bombardearon dos veces mediante la preparación de partıculas y el procedimiento biolıstico estándar (Sanford et al., 1993) con una liberación eficaz de 0,8 μg de la construcción intragénica precodificada sobre 0,5 mg de partıculas de tungsteno (0,4 μ m de diámetro) Por disparo. La composición de todos los medios de cultivo se realizó de acuerdo con previamente descrito por Garrocho-Villegas et al. (2012). Para cada ensayo, se colocaron 0,3 g de callos en el centro de cada una de 10 placas de Petri de medio N6P solidificadas con 3,5 g / l de gelrita. Como control, la misma cantidad de callos se trató sólo con partículas de tungsteno. Después de 24 h de bombardeo, los callos se transfirieron a medio N6P con 2,5 g / l de gelrita. Se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante una semana. Los callos se transfirieron posteriormente 3 veces, cada 15 a 20 días, a un medio N6P fresco. La regeneración de la planta se produjo a lo largo de otros 3 subcultivos que disminuyeron la concentración de theauxin en el medio N6P (50%, 25% y 0%, respectivamente) sin agregar un agente de selección. Las plantas resultantes se mantuvieron en medio MS enriquecido con 1 mg / l de ácido indolbutírico para ayudar al proceso de enraizamiento. En esta etapa, las subculturas se generaron cada 25 a 35 días en botellas de vidrio. Finalmente, cuando las plantas desarrollaron aproximadamente 7 cm de raíz primaria, fueron plantadas en sustrato orgánico (Sunshine No 3) en macetas de 1 L. Se cubrieron con plástico transparente y se mantuvieron en el invernadero a 25-35◦C con fotoperiodos de 12 h de luz / oscuridad. Las cubiertas plásticas se perforaron gradualmente hasta que se retiraron completamente.

2.4. Identificación de plantas de maíz intragenic Las plantas intragénicas se identificaron a través de PCR de punto final de PCR Taq polimerasa Kapa 3G, con oligonucleótidos Pares 1 y 2 diseñados para detectar la cinta de sobreexpresión en dos diferentes fragmentos de unión. La Tabla 1 describe los oligonucleótidos usados. Los resultados se visualizaron en geles de agarosa. El gen 18 S se usó como control interno.

2.5. Análisis de la expresión de Rca Durante la etapa de floración, se recolectaron muestras de 1 cm2 de las hojas inmediatamente por encima del oído de las plantas intragenic identificadas y sus controles, así como de plantas de los cultivares Z0 y Z23. El ARNm de Rca se cuantificó usando RT-PCR en tiempo real con oligos de TRR (Tabla 1). El ARN total se aisló mediante Quick-RNAMiniPrep (Zymmo Research) con DNasa. A partir de 1 μg de ARN, se sintetizó cDNA con oligos dT (Thermo Scientific MaximaH Minus First Strand), cuantificado con NanoDrop 2000 Thermo Sci-entific, y la reacción de PCR en tiempo real se realizó con SYBRGreenER qPCR SuperMix Universal Life Sciences de acuerdo con Instrucciones del fabricante. La expresión del RNA mRNA se normalizó con respecto al gen del grupo de alta movilidad de referencia (Hmg), número de acceso AJ131373. Los datos se analizaron estadísticamente utilizando la prueba de Student para muestras independientes (p = 0,05). La cantidad de proteína Rca se analizó por triplicado utilizando los borrones de West-ern (anticuerpo Agrisera, código de producto AS10 700), según Yamori y von (2011). Se analizaron los geles de los extractos proteicos totales Utilizando densitometría relativa (densitometría unidades / área) con respecto a las plantas de control (Bio Rad Image Lab Software) .2.6. Rca número de copias determinationGenomic ADN fue extraído de cada identificado intragenicplant y sus controles, así como plantas de Z0 y Z23culti-vars. Los tiempos de integración de la región codificadora de Rca en cada planta se determinaron usando RT-PCR en tiempo real con SYBR GreenER (Life Sci-ences) y TRR oligos (Tabla 1). Adicionalmente, se utilizaron oligonucleótidos CIS para identificar la unión quimérica del promotor Rco - gen Rca insertado en el ADN de plantas intragénicas. Cada RT-PCR se realizó por triplicado. Se generaron curvas estándar con 1000 pg, 10 pg, 0,1 pg y 0,001 pg del plásmido puc 57 para estimar la cantidad de secuencia amplificada presente en el genoma de planta correspondiente. Consideramos 2.4 Gb como el tamaño del ADN del maíz (http://www.gramene.org/) y un peso molecular promedio del par de bases: 650 Da, para obtener el número de copias del gen por planta. Los resultados se normalizaron al gen Hmg. Los pares de oligonucleótidos se validaron mediante curvas de disociación y eficiencia.

3. Resultados y discusión3.1. Identificación de RCA-overexpressing plantas intragénicas Para obtener Rca-overexpressing maíz intragénico, un procedimiento biolistic se utilizó para transferir el casete intragénico directamente. Porque El propósito de generar las plantas intragénicas consistía en mantener la integridad del ADN, -referido como la ausencia de las integraciones de ADN extrañas-, todo el proceso de transformación se realizó sin agentes de selección química. La Tabla 2 muestra el número de plántulas regeneradas después de 173 días de bombardeo. El análisis de las hojas de maíz obtenidas después del proceso de regeneración y aclimatación se analizó para identificar plantas intragénicas a través de la amplificación de las uniones quiméricas de Rca con el promotor y / o terminador de la enzima Rubisco en La estructura intragénica. Higo. 1 describe los oligonucleótidos utilizados. Durante esta etapa, se identificaron 5 plantas intragénicas de un total de 164 plantas regeneradas; Esto indica que el 3% de los