Histologia Tipos de Microscopio

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MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMICIÓN

Los rayos de iluminación atraviesan la muestra y son enfocados por las lentes del objetivo y de proyección para forma una imagen aumentada sobre una pantalla fluorescente. Sin embargo, el microscopio electrónico es mucho más complejo. (2)

Para que los electrones puedan ser acelerados hasta la velocidad prefijada, debe trabajarse en condiciones de alto vacío (lo-' a lo-' torr; 1 torr = 1 mm de mercurio a 0°C). El sistema central del microscopio electrónico incluyendo la pantalla fluorescente y el equipo fotográfico, lo constituye un tubo hueco. El equipo eléctrico que suministra la corriente necesaria se halla generalmente situado a una cierta distancia para evitar la interferencia de los campos magnéticos dispersados. (2)

La mayoría de los microscopios están equipados con dispositivos de seguridad que no permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no se ha conseguido el vacío apropiado. Las lentes magnéticas del microscopio electrónico están formadas por imanes en forma de herradura. El imán puede ser permanente o de tipo electromagnético. Variando la potencia de la corriente a la lente se consigue el efecto de variar la distancia focal de la lente continuamente, lo cual es muy similar al sistema de "zoom". Sin embargo, normalmente se preselecciona la corriente deseada. Se pueden ajustar los voltajes de aceleración en una gama que incluye 40, 60, 80 y 100 Kv, etc. Ajustando Kv a un nivel inferior, se consigue aumentar el contraste. (2)

Componentes del microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Cañón electrónico. El tipo más [usado de cañón electrónico consiste de un filamento de alambre de tungsteno doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de diámetro centrada en el ápice del filamento. La superficie cóncava hace las funciones de ánodo, y utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrónica puede reducirse en tamaño respecto al electrodo cóncavo. 1a intensidad total de haz de cátodo a ánodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequeña fracción die éste llega hasta la muestra. (2)

Condensadores. Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad ajustando el cañón electrónico. Esto reduce el área iluminada en la muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra también sufren los efectos del haz electrónico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminación. (2)

Plataforma para la colocación de la muestra. La plataforma para colocar la muestra está situada en frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del microscopio a través de una abertura. (3)

Objetivo. El objetivo de la lente más importante en el microscopio electrónico. La distancia foca1 de esta lente está comprendida entre 1 y 5 milímetros, siendo 1 mm la más frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolución. Debido a que el haz de imagen tiene la máxima apertura angular en el primer objetivo, esta lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberración esférica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite, introducir metal para compensar la homogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolución. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la dispersión de los electrones, evitando así la degradación de la imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrómetros (pm) los más frecuentes. (3)

Lente intermedia. La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente. (3)

Lente de proyección. La lente (de proyección corresponde al ocular del microscopio óptico. Su función es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliación de 100 X hasta 300.000 X usando lentes intermedias y de proyección. (3)

Cámara de observación. La cámara de observación y la pantalla fluorescente están situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 10 X. El diámetro del punto de enfoque es de 100 um, por 10 tanto la imagen debe ser mayor que [este diámetro para ser resuelta. La cámara de observación está protegida por un vidrio grueso de plomo para evitar la emisión de rayos X. (3)

Cámara fotográfica La cámara fotográfica está situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla fluorescente está sujetada, por un lado, y al quitar el paso del haz electrónico la imagen se centra sobre la película fotográfica. Se pueden usar varios tipos de películas y placas de vidrio. (3)

[pic 4]

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MICROSCOPIO DE EPIFLUORESENCIA

Microscopía de fluorescencia Descubierta en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulada por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosas. (4)

[pic 5]

“Células epiteliales teñidas con DAPI (azul) y dos anticuerpos (verde y rojo)”

Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. (4)

La fluorescencia acoplada a un microscopio “tradicional” se le denomina “epifluorescencia” porque se inserta por encima del sistema óptico (objetivos de aumento), trabajando por reflexión lumínica. (5)

El microscopio óptico necesariamente debe tener alguna característica especial para que sea nuestro perfecto aliado en nuestro trabajo de bioindicación con fluorescencia. Hablaremos de objetivos que tengan una buena transmisión lumínica (los fabricantes diseñan objetivos con lentes de “fluorita” con mayor transmisión lumínica para estos efectos, aunque