LABORATORIO DE CINETICA ENZIMATICA

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Figura 2

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Las enzimas deben estar unidas a otras moléculas para poder funcionar de una manera más eficiente, es decir, para ser activas. Así por ejemplo solo la parte proteíca o la fracción proteíca de la enzima es denominada apoenzima y es catalíticamente inactivo; mientras que la parte no proteína se denomina cofactor, que pueden ser pequeñas moléculas de naturaleza orgánica o inorgánica que la apoenzima va a necesitar para ser activa; este último es muy similar a los grupos prostéticos con la diferencia de que estos están unidos a la enzima más fuertemente. Finalmente se va a denominar holoenzima a la encima activa y esa encima activa va estar formada por la apoenzima, el cofactor o grupo protético para que la enzima funcione de una manera más eficiente.

Figura 3

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*algunas enzimas necesitan una porción no proteica para desempeñar su función.

Realizar ensayos en el laboratorio en diferentes condiciones experimentales para estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas aporta información sobre aspectos como la afinidad de la enzima por el sustrato o la eficiencia con la que se transforma ese sustrato en el producto de la reaccion.

La velocidad de las reacciones enzimáticas de un solo sustrato se realizan mezclando una concentración conocida de enzima con una concentración concreta de sustrato y midiendo la desaparición de producto a lo largo del tiempo,(Esta medida dependera de sus características químicas). En la práctica realizada en el laboratorio, trabajamos con la enzima de fosfatasa alcalina, esta cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a PH alcalino,(es decir en un rango de 8-10),lo que libera fosfato al medio. Para ello, se utilizo la actividad de esta enzima que emplea como sustrato el p-nitrofenilfosfato, cuya hidrólisis da lugar a fosfato y a p-nitrofenol. Este último adquiere color amarillo a PH alcalino. Con este obtuvimos la curva de progreso de la reacción catalizada y se determino la velocidad inicial y la concentración enzimatica, esto lo podemos hacer mediante el modelo del estado estacionario y la ecuación de Michaeles-menten y el análsis lineal de dicha ecucación, es decir la representación de Lineweaver-Burk. Estos modelos consisten en:

El primero explica el comportamiento de las reacciones en las que la concentración del complejo enzima sustrato permanece constante y la concentración de sustrato es muy superior a la de la enzima. Veamos:

Figura 4

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*Ecuación de Michaelis-menten.

El segundo consiste en transformar la ecuación de Michaelis Menten en una ecuación algebraica que aporte datos numéricos concretos cocretos para los parámetros cinéticos ( Vmax- Km); asi:

Figura 5

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*Ecuación de Lineweaver-Burk.

Es importante tener en cuenta que hay factores externos que alteran la actividad enzimática, entre los que se encuentra:

Concentración de enzima: la velocidad de reacción catalizada por una enzima va a depender directamente de la concentración de la misma enzima; si la concentración de la enzima aumenta, la velocidad de la reacción también va aumentar directamente.

Concentración de sustrato: la concentración de sustrato va en directa proporción a la velocidad de la reacción hasta cierto punto, mientras aumenta la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción también va aumentar proporcionalmente hasta llegar a un punto donde va a encontrarse mayor concentración de sustrato que de enzima, a partir de ese punto cualquier sustrato no va a producir un cambio significativo en la velocidad de la reacción y esto es debido a que los sitios activos de las enzimas van a estar cubiertos por el sustrato.

Temperatura: el aumento de la temperatura ocasiona un aumento de la velocidad en las moléculas tanto de la enzima como de las de sustrato, que tiene un límite; cuando se sobrepasa la temperatura de desnaturalización de la enzima, con lleva a una pérdida de su función o que ocurran colisiones moleculares.

PH: los cambios en PH pueden afectar la unión entre sustrato y enzima lo cual puede ocasionar la ruptura de diversos enlaces en la enzima, esto a su vez va a tener como consecuencia un cambio en la forma de la enzima, es decir en su sitio activo y finalmente la enzima se desnaturaliza. Es importante recordar que los valores de PH optimo van a depender de qué tipo de enzima estemos revisando.

Así como los cofactores o grupos protéticos son necesarios para que las enzimas pueden ser activas durante la reacción bioquímica, existen sustancias que pueden reducir o detener la actividad catalítica o enzimática. Esas sustancias bloquean o distorsionan el sitio activo de la enzima y por esa razón son denominados inhibidores ya que influyen en el desarrollo de la reacción. Podemos identificar según la característica de estos, diferentes clases de inhibidores que actúan en determinados sitios de la enzima, por ejemplo: En la inhibición competitiva el inhibidor se une al sitio activo, impidiendo la formación del complejo enzima sustrato, debido a esto la velocidad máxima sin inhibidor es igual a la velocidad máxima con inhibidor; pero su km y kmi cambia ya que el inhibidor competirá con el sustrato por entrar al sitio activo. Otro tipo de inhibición es la no competitiva, en esta el inhibidor se une en un lugar distinto al sitio activo lo que permite a la enzima unirse en él; por tanto, su efecto no se puede evitar, aumentando la concentración de sustrato y produce una reducción en la velocidad máxima. En este caso, al no unirse el inhibidor al sitio activo su km no cambia. Existen inhibidores que se unen exclusivamente al complejo enzima sustrato en un lugar diferente al sitio activo, lo que produce una disminución del vmaxi y kmi; este tipo de inhibidor se denomina acompetitiva. Por último, la inhibición mixta se refiere a la unión de dos inhibidores reversibles, (la inhibición competitiva y la no competitiva). Este término se usa cuando el inhibidor se puede unir tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato; en este caso el inhibidor se une a un lugar distinto del sitio activo.