LABORATORIO DE QUÍMICA INSTRUMENTAL.

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Según las características y concentraciones de los compuestos implicados en la separación cromatográfica se puede escoger el detector más adecuado para cada aplicación. De manera general se distinguen dos tipos básicos de detectores. El primero de ellos engloba los que están basados en la medida de una propiedad de la disolución, que se verá afectada por la presencia en la misma de las moléculas que se van a separar, destacando los detectores que miden el índice de refracción, la constante dieléctrica y la densidad. El segundo tipo está formado por aquellos que miden una propiedad de los compuestos que se desean separar, destacando los de absorbancia, los de fluorescencia y los de espectrometría de masas.

Una práctica común en HPLC es el uso de dos detectores, colocados en serie o en paralelo en función de las características de la muestra, fundamentalmente de la concentración de las moléculas de interés.

Columnas:

Las columnas son un elemento esencial para que transcurra la separación cromatográfica. La fase estacionaria está contenida en un tubo con terminaciones, aislada por ambos lados, que debe ser capaz de contener la presión generada en su interior tanto durante su fabricación como durante su uso. Las columnas deben proporcionar un camino controlado y adecuado para la entrada y la salida de la muestra, sin fugas, con el mínimo volumen posible y sin volúmenes muertos. Además deben ser químicamente inertes respecto al sistema de separación (muestra, fase móvil y fase estacionaria).

La mayor parte de las columnas están construidas en acero inoxidable para conseguir la mayor resistencia posible a la presión. El PEEK (un plástico de última generación) y el cristal, aunque son menos resistentes a la presión, pueden usarse cuando se requieren superficies inertes para aplicaciones especiales de tipo químico o biológico. La columna de cristal ofrece la ventaja de poder detectar visualmente la separación que tiene lugar en su interior.

Las dimensiones de una columna se deben escoger en función de la escala de separación cromatográfica que se va a realizar, analítica o preparativa. En las separaciones analíticas se utilizan columnas con pequeño diámetro interno, con la única finalidad de cuantificar e identificar los componentes presentes en una mezcla. Sin embargo, en la cromatografía preparativa se emplean columnas con diámetros internos mayores, para purificar y colectar compuestos puros a partir de una mezcla compleja, usando para ello un colector de fracciones situado a continuación del detector. Por otro lado, la longitud de la columna suele estar determinada por el grado de separación entre componentes que se desee obtener.

Otro parámetro que diferencia las columnas cromatográficas entre sí es su relleno. Existen dos tipos básicos de relleno: pelicular y de partícula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas, con diámetro de 30 a 40 micras. En su superficie de deposita una capa delgada y porosa, que suele ser de sílice, de alúmina, de una resina sintética de poliestirenodivinilbenceno o de una resina de intercambio iónico. El recubrimiento también puede ser una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción, una capa superficial orgánica,... Los rellenos de partícula porosa están formados por micropartículas porosas de pequeño diámetro y con la menor dispersión posible. Las partículas en este caso también son de sílice, alúmina, resina sintética de

poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio iónico. Las partículas de sílice se preparan aglomerando partículas de sílice de tamaños inferiores en unas condiciones tales que se forman partículas mayores de diámetros muy uniformes.

Las partículas resultantes a menudo se recubren con partículas orgánicas unidas física o químicamente a la superficie.

La resolución cromatográfica es el grado de separación conseguido para dos componentes de una mezcla. Hay dos factores principales que determinan el poder de separación o resolución que se puede alcanzar en una columna de HPLC: el poder de separación mecánico, debido a la longitud de la columna, el tamaño de partícula y la uniformidad del empaquetamiento, y el poder de separación químico, debido a la competición físico-química de los compuestos de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil. La eficiencia mide el poder de separación mecánico y la selectividad mide el poder de separación químico.

El poder de separación mecánico en una columna estable y uniformemente empaquetada está determinado por su longitud y su tamaño de partícula y a menudo se mide y se compara por el número de platos (N). Los tamaños de partícula más pequeños producen mayor eficiencia y mayor presión. Si se mantiene constante el tamaño de partícula se conseguirá mayor separación mecánica cuanto mayor sea la longitud de la columna. Las desventajas correspondientes son mayores tiempos de pinchazo, mayor consumo de disolventes y mayor presión.

El poder de separación químico vendrá determinado por la combinación de fase móvil y fase estacionaria. Para conseguir una buena separación entre analitos lo mejor es optimizar esta variable y escoger el modo de cromatografía o mecanismo de retención adecuado.

A menudo para aumentar la vida útil de una columna se utiliza una pre-columna colocada delante de la columna, que sirve para eliminar la materia en suspensión y los componentes de la muestra que se unen de forma irreversible a la fase estacionaria. La composición del relleno de pre-columna y columna ha de ser similar, mientras que el tamaño de partícula puede ser mayor en la pre-columna. Un sistema de HPLC consta en ciertos casos de un horno para mantener la columna a la temperatura requerida para que tenga lugar la separación cromatográfica. Estos hornos pueden ser capaces de controlar la temperatura en décimas de grado, desde temperatura ambiente hasta 100 ó 150ºC.

Observaciones:

La cromatografía HPLC es parte de la cromatografía líquida, en la que la fase móvil es un líquido que circula en íntimo contacto con un la fase estacionaria, basado en las propiedades químicas del compuesto a analizar.

El equipo Agilent/HP 1100 Static, que funciona con el programa Online-Offline, consta de un dispositivo de suministro de eluyentes, en pocas palabras, una bomba para 4 solventes que trabaja a 300 Bar, con un flujo desde 1 a 1.5 mL/min y genera un presión para la una mejor difusión mediante la utilización de solventes ultra puros, un desgasificador