Los métodos experimentales para conocer la actividad catalítica

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En la Gráfica. 1, la actividad enzimática de la LDH tiene lecturas de absorbancias hasta los 90 segundos, correspondientes a la velocidad inicial de la enzima, donde se puede evaluar su comportamiento con y sin inhibidor, se observa que a mayores concentraciones (0.25, 0.36 y 0.5 de piruvato) la actividad de la enzima disminuía rápidamente.

Siendo así, se realizó el análisis de datos hasta los 33 segundos, obteniendo la Gráfica. 3 de Michaelis­Mente​n en la que se puede observar que con respecto a las velocidades, a bajas concentraciones del sustrato no es apreciable el efecto inicial de la actividad enzimática, pero al aumentar su concentración se observa que la diferencia de la actividad de la enzima con y sin inhibidor a las velocidades iniciales no es grande (dado las unidades en las que se midió). ​Con estos resultados, se puede ver que si se aumenta el número de ensayos con mayores concentraciones del sustrato se puede obtener una gráfica completa de la actividad que, tiende a ser del tipo competitivo.

Realizando el análisis matemático de los datos obtenidos, se puede ver que en la Gráfica. 4 de Linealización de Lineweaver­Bur​k​, se realizó la extrapolación de los datos considerados que ambas rectas tienden a intersectarse cerca del eje de las “Y”, coincidiendo con el comportamiento de un inhibidor mixto aunque teóricamente debió intersectarse sobre el eje de las “Y” ya que el oxamato de sodio es un inhibidor competitivo pues su estructura es similar a la del sustrato de la LDH, con lo cual, ambos compiten por el sitio activo. Esto pudo ser resultado a que en los órdenes de magnitud de los datos obtenidos para graficar, se

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omitieron los datos correspondientes a menores cantidades de sustrato (0.06, 0.09 y 0.15) para que la gráfica se evaluará mejor ya que es comparable con la cantidad de oxamato contenido en la celda. Otros factores que pudieron influir es que se utilizaron volúmenes pequeños aumentando el error por el manejo de las micropipetas, o fallas al preparar las mezclas de reacción, el no mezclarlas adecuadamente y en consecuencia que el sustrato, cofactor y enzima, además de inhibidor según el ensayo, no interaccionaran de manera adecuada dando resultados erróneos.

De acuerdo con la ecuación de la gráfica de dobles recíprocos, se obtuvieron los valores de V máxima y Km (constante de afinidad) en la Tabla. 1, en los cuales, se puede ver que no hay un cambio significativo en los valores de la velocidad máxima (0.0015 sin inhibidor y 0.0012 con inhibidor) y se puede ver un aumento significativo en la constante de afinidad obtenida (Km sin inhibidor: 0.82; Km con inhibidor: 1.24), pese a que existe cierta diferencia entre los valores de Km con y sin inhibidor obtenidos por medio de este método, esta diferencia no puede considerarse como significativa debido a los valores tan pequeños que se presentan. Es por este motivo que no puede determinarse de manera concreta el tipo de inhibición que está ejerciendo el oxamato sobre la LDH, al tener valores muy similares para Km y Vmáx, una solución a este conflicto presentado sería el aumento de la concentración de LDH utilizada en el ensayo, esto con la finalidad de observar cambios en los valores numéricos más notorios o utilizando programas de computación especiales que calculen dicos valores para que sean más precisos.

● CONCLUSIÓN

No se logró determinar el tipo de inhibición que ejerce el Oxamato sobre la enzima LDH, debido a que la diferencia en los parámetros farmacocinéticos evaluados (Km y Vmax) no presentaron una gran variación en los ensayos con y sin inhibidor, para poder determinar el tipo de inhibición que ejerce sobre la enzima, tendrían que repetirse los ensayos realizados con una concentración mayor de enzima que nos permita observar una diferencia más significativa entre las variables cinéticas medidas.

REFERENCIAS

❖ Garrido A. et al. Fundamentos de bioquímica estructural. (2006).Editorial Tébar: Madrid. ❖ Voet. Bioquimica. 3ra edición. (2004). Editorial Médica Panamericana: Buenos Aires.