Paper "Origen procariotico de la actina del citoesqueleto"

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La imagen filtrada (Fig. 2d) del polímero en la Fig. 2b (diámetro de aproximadamente 160A e) aparentemente muestra dos filamentos delgados, con una separación de aproximadamente 51A Ê longitudinal (Fig. 2c). Los filamentos delgados parecen carecer el giro distinto de los dos varados-hélices de Factin, aunque a menudo parecen tener un ligero giro. A bajas concentraciones de NaCl (25 mM NaCl), MreB forma láminas cristalinas de dos dimensiones (Fig.2e).

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Figura 1 Ensayos de polimerización MreB. MreB se incubó a

37 ° C con nucleótidos y NaCl, y se centrifugó a 140,000g. S, sobrenadante; P, pellet solubilizado. Proteínas se separaron en un gel de SDS 12% y se tiñeron con la página 83. a, Efecto de nucleótidos y del magnesio. MreB requiere ATP o GTP, pero no magnesio, para la polimerización. b, pH óptimo. MreB se incubó bajo condiciones estándar (ver Métodos) con tampón amortiguador de 100 mM: citrato de pH 4, pH 5, MES pH 6, HEPES pH 7, Tris-HCl pH 8, bicina pH 9. Granulación máxima se observó a pH 6 ± 7.

El patrón de difracción de las láminas también muestra una fuerte línea de capa en 51A E, y, además, una separación de 39A E en el plano ecuatorial (Fig. 2f). Imágenes filtradas de las láminas (Fig. 2g) muestran filamentos individuales que son consistentes con las de los protofilamentos en la estructura cristalina (véase más adelante). Ellos parecen estar relacionados a las láminas de gadolinio de actina inducido, que consisten en protofilamentos no trenzados dispuestos en una conformación antiparalela. Es posible, pero aún no determinado, que las láminas MreB también tiengan una disposición antiparalela de protofilamentos.

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Figura 2 Las micrografías electrónicas de filamentos MreB manchadas negativamente. a.Vista típica de filamentos MreB cuando se utiliza sal y pH neutro. Se incubó MreB (1 mg ml-1) durante 30 min a 37°C en 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 3 mM de CaCl2, 2 mM ATP (protegido) y 4 mM MgCl2. Barra de escala, 100 nm. El filamento indicado con una fleche es el mismo filamento que se muestra con un aumento mayor en b.

b. `Doble' filamento formado en pH alto. Se incubó MreB (1 mg ml-1) durante 30 min a 37°C en 100 mM BICINE, pH 9.0, 100 mM NaCl, 2 mM ATP protegido) y 4 mM MgCl2. Barra de escala, 100 nm. c. La imagen de difracción del polímero en b muestra la primera línea de capa fuerte en 51 A. d. La imagen filtrada de b, trata ambos filamentos por separado. El polímero tiene cerca de 160 A de amplitud, lo que sugiere que son solo cuatro filamentos en total (cada 40 A, ver Fig. 5). e. La micrografía electrónica de una hoja MreB manchada negativamente. MreB (1 mg ml-1) se incubó durante 30 min a 37°C en 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM de NaCl, 2 mM ATP (protegido) y 4 mM MgCl2. Los protofilamentos se alinean verticalmente en las hojas MreB. Barra de escala, 100 nm. f. Imagen de la difracción de la hoja en e. La repetición longitudinal es 51 A, la separación lateral es 39 A. g. Imagen filtrada de la hoja en e. h. Los protofilamentos encontrados en los cristales de MreB encajan bien con la imagen filtrada en g. La repetición longitudinal de 51 A en las hojas es igual que en los cristales (Fig. 5). La separación lateral en las láminas sugiere que los protofilamentos interactúan con sus lados planos.

El análisis microscópico de electrones muestra que los polímeros que se encuentran en el ensayo de granulación y en todas las demás condiciones ensayadas tienen un espaciado longitudinal de 51A E, que es una reminiscencia de la separación Ê 55A de hebras helicoidales de F-actina.

Estructura cristalina de MreB

Para investigar la homología de MreB de actina en detalle atómico, se determinó la estructura tridimensional de MreB. Se obtuvieron cristales trigonales y monoclínicos de MreB de T. maritima. Los cristales trigonales, grupo espacial P3121, difractan a 2,1 A pero fueron emparejados parcialmente. La estructura fue resuelta por dispersión anómala múltiple (MAD), utilizando los cristales monoclínicos (grupo espacial C2, ver Métodos e Información Complementaria Tabla 1). Las estructuras de apo- (NATI) y AMPPNP que contienen cristales trigonales se resolvieron por reemplazo molecular (Tabla 1).

La estructura de MreB confirma que es un miembro de la familia de proteínas de actina, y se caracteriza por dos dominios (I y II) que mantiene un sitio de unión del nucleótido en la hendidura entre dominios12. Cada dominio se subdivide en dos subdominios (A y B) (Fig. 3). Los dos subdominios más grandes (IA y IIA) tienen un pliegue común que comprende una B-hoja de cinco hebras rodeada por tres a-hélice. Estos subdominios están conectados a través de una hélice, H4. Los subdominios más pequeños (IB y IIB) son más diversos en la superfamilia de actina, y probablemente son únicos para la función específica de las proteínas. En particular, MreB muestra exactamente la misma topología como actina en la estructura de estos dominios (Fig. 4). Esto está en contraste con Hsp70, FtsA y, en particular, las quinasas de azúcar. La posición en la que se insertan los subdominios más pequeños es idéntica en las dos proteínas, es decir, después de la tercera hebra (S3 y S11, respectivamente) de b-meandro de ambos subdominios IA y IIA. Una diferencia importante entre la actina y MreB es un bucle que se inserta en la actina en el equivalente de hélice H8. El bucle se ha implicado en la interacción intermolecular entre las subunidades durante el montaje inicial del filamento3.

La búsqueda de una semejanza estructural tridimensional reveló que MreB se puede superponer a la actina (Proteína Data Bank (PDB).

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Figura 3 Representación de la cinta de la estructura cristalina de un MreB complejo con AMPPNP y magnesio. MreB es un miembro de la familia de las proteínas actina, mostrando la arquitectura típica de cuatro dominios. AMPPNP se une en una hendidura entre los dominios I and II. Los cuatro subdominios IA, IB, IIA y IIB corresponden a los subdominios 1, 2, 3 y 4 en la actina. Prácticamente ningunas diferencias son perceptibles a partir de las dos estructuras de cristal no unidas al ligando (HRES, NATI).

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* La fracción de emparejamiento que se utiliza en el refinamiento, el operador -h, -k, l.

² Cinco por ciento de las reflexiones se seleccionaron al azar para la determinación del factor R-libre (teniendo en cuenta el emparejamiento