Propósito de la extracción de ADN

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Métodos de extracción de ADN en fase sólida

Con el deseo de automatizar el proceso de análisis de ADN muchos laboratorios han avanzado a varias formas de extracción en fase solida donde el ADN es selectivamente ligado a un sustrato como por ejemplo partículas de sílice, el ADN es retenido mientras proteínas y otros componentes celulares son lavados, entonces el ADN es liberado en forma pura.

- Columnas QIACEN:

Los ácidos nucleicos se absorben selectivamente a sílice sobre un soporte como perlas de vidrio, en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas como por ejemplo clorhidrato de guanidina, yoduro de sodio, estas sales interrumpen los puentes de hidrógeno en agua y de este modo hacen que se desnaturalicen proteínas y ácidos nucleicos.

Si la solución tiene un pH más acido que 7,5 la absorción de ADN a la sílice es alrededor del 95% e impurezas no deseadas pueden ser lavadas (retiradas). Bajo condiciones alcalinas y bajas concentraciones de sal, el ADN eluirá eficientemente del material de sílice.

Este método de extracción con fase puede ser realizado con centrifugación o filtración al vacío en tubos individuales o formatos de placa.

- DAN IQ : Para aislamiento y cuantificación

Utiliza la misma base de unión a sílice, pero la sílice es recubierta con una resina paramagnética y químicos de elución como QIAGEN kits, las impurezas de la solución, son fácilmente removidas retirando el líquido de las perlas. Las partículas magnéticas con ADN adjunto pueden ser lavadas múltiples veces para una mejor limpieza del ADN.

Dado que los procedimientos de centrifugación o filtración al vacío no son usados en este método, las perlas magnéticas son procedimientos mas rápidos, simples y automatizados.

Este proceso es dependiente del enlace entre el ADN y las perlas magnéticas, si algo interfiere con este enlace ADN pude ser perdido en los lavados

- PrepFiler

Utiliza partículas magnéticas permite el aislamiento de alta calidad de DN de muestras forenses en altos rendimientos como fluidos corporales, y las manchas e hisopos de fluidos corporales. Los altos rendimientos se deben a que utilizan un cordón pequeño usado para proveer mayor área de superficie.

LA EXTRACCIÓN DIFERENCIAL

Es una modificación a la extracción orgánica habitual se usa para separar ADN masculino y femenino de una muestra normalmente proveniente de un evento de agresión o violación es muy usado por el FBI para encontrar al agresor.

Las muestras para evidencia femeninas suelen ser células epiteliales y masculinas el semen.

Procedimiento

- A la evidencia se le añade una mezcla de SDS, proteinasa K y DTA para romper las células epiteliales incubando a 37ºC y se centrifuga.

- El sobrenadante se extrae para analizar el ADN femenino

- Los pellets de esperma que queda como precipitado luego de la reacción se trata con una mezcla de: SDS, EDTA, proteinasa K y DTT ( en el q los puentes de disulfuro tiñen las membranas nucleares del esperma) entonces se obtiene el ADN masculino para análisis.

- Cuando no existe suficiente evidencia o carece de esperma se procede a usar indicadores específicos del cromosoma Y para deducir el perfil del ADN del agresor.

OTROS MÉTODOS PARA SEPARAR EL ADN MASCULINO DE LA EVIDENCIA

MICRODISSECCION POR CAPTURA CON LASSER

Es comúnmente usado para separar las células tumorales del tejido circundante en el microscopio, pero también puede ser usado para identificar el ADN del agresor.

Cuando se observan las células del esperma se activa un laser diminuto luego se coloca un film de plástico y el laser captura o encierra las muestras de interés.

El film es transferido a un tubo donde el ADN del esperma aislado puede ser extraído y aplificado usando un PCR.

PCR DIRECTO SIN EXTRACCIÓN DE ADN

Reacciones mejoradas y una ADN polimerasa modificada permite realizar un pcr directo sin realizar la extracción y purificación de ADN en el q normalmente se pierde material cuando se realizan estos lavados . Existen kits llamados Direct STR typing que permiten realizar este procedimiento