Proteómica de diferentes partes de la planta Moringa oleífera de Venezuela

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Luego se centrifugó a 15000 g por 5 min a 4 °C, se resuspendió el precipitado en 1,5 mL de TCA/acetona fríos procurando agitar con la pipeta para lavar eficazmente elprecipitadoy agitando30 s en el vórtex. Se centrifugóde nuevo a 15000g por 5 min a 4°C. Este último paso se repitió dos veces más.

Posteriormente, se resuspendió el precipitado en 1,5 mL de acetona al 100%, se agitó durante 30s en el vórtex yse centrifugó a 15000 g por 5 min a 4°C.

El precipitado se dejó secar en la campana para la eliminación por evaporación de los restos de acetona.

- Extracción de proteínas

Se resuspendió el precipitado seco en 1,5 mL de Buffer de extracción de SDS (0,15M Tris-HCL, pH 6,8) y se agitó en el vórtex hasta disolverlo.

Luego se centrifugó a 15000 g por 10 min a temperatura ambiente. Se descartó el precipitado y se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos.

- Extracción con fenol

Se adicionó un volumen igual de buffer fenol pH 8 (0,5 mL) al obtenido en el sobrenadante. La mezcla se agitó por vórtex durante 3 min y luego se centrifugó a 15000 g por 5 min a temperatura ambiente.

Se conservó la fase fenólica descartando la fase superior y la interfase. Luego, se adicionó un volumen de buffer de lavado I (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA y 0.7 M sacarosa),)igual al de la fase fenólica mezclándose durante 5 min en el vórtex.

Finalmente, se centrifugó a 15000 g por 5min a temperatura ambiente, conservando la fase fenólica y descartando la fase superior y la interfase.

- Solubilización de proteínas

Se transfirió la fase fenólica en iguales proporciones a tubos nuevos de 1,5 mL, adicionándoseles acetato de amonio0,1 M en metanol hasta completar un volumen final de 1,5 mL en cada tubo. La mezcla fue agitada en el vórtex durante 30 s. Se colocó a -20 °C durante 12 h. Posteriormente, se centrifugó a 15000 g por 15 min a 4°C, conservando el precipitado y descartando el sobrenadante.

Se le adicionó 1 mL de acetato de amonio en metanol y se agitó en vórtex durante 30 s. Se realizó otra centrifugación durante 5 min a 15000 g a 4°C. Se conservó el precipitado y se descartó el sobrenadante.

- Lavado con acetona

Para finalizar, se adicionó al precipitado anterior 1 mL de acetona al 80% a temperatura ambiente, se agitó en vórtex durante 30 s y se realizóuna última centrifugación a 15000 g por 5min. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se deja secar a temperatura ambiente.

- Cuantificación proteica mediante el método de Bradford

Para la cuantificación y la electroforesis, se acumuló la mayor cantidad posible de precipitados resultantes de todos los tubos. Cada uno fue resuspendido y disuelto en 100 µL de buffer de rehidratación 2D (7M urea, 2M thiourea, 4% (m/v) CHAPS, 2% (v/v) IPG buffer, pH 4–7, 20 mM DTT and 0.001% (m/v)). El procedimiento se realizó para cada extracto por separado.

Se utilizó la BSA como proteína de referencia para la formación de una curva estándar de 0.5, 0.35, 0.25, 0.15 y 0.05 μg/μL para la posterior cuantificación relativa de proteínas.

Para la medición se realizó una dilución de 1/50 para las muestras de hojas y flores y para las muestras de semillas y de vainas jóvenes, se realizó una dilución 1/10. Luego, se tomaron alícuotas de 10 μL, añadiendo 200 μL de reactivo de Bradford.

La cuantificación se realizó midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro, a 545 nm, y graficando la absorbancia vs la concentración de proteínaBSA obteniendo una curva de calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se pudo interpolar la concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 545 nm. El procedimiento se realizó con todos los extractos.

- Procedimiento para la evaluación del patrón de bandas de proteínas en los extractos de Moringa oleifera.

La cantidad de extracto total a utilizar para identificar la presencia de proteínas anómalas en el ensayo electroforético, se calculó en base a la ecuación de la rectagracias a la calibración anterior; permitió determinar el uso de 80 µg de la muestra de hojas y 50 µg de las muestras de semillas, vainas y flores paracorrer en un gel de poliacrilamida al 12 %, en condiciones reductoras.

El gel se sometió a una diferencia de voltaje de 60 v durante 30 min y luego de 110 v por 2 h, con amperaje libre en ambos casos.

Se realizó latinción del gel con Azul de Coomassie, luego de locual se escaneó y se procesó para determinarel peso molecular aproximado de las proteínas,comparando la movilidad electroforética de las proteínas de la muestra con las del patrón.

- Resultados

- Resultados del análisis de Bradford

Utilizando el método de Bradford, mediante la obtención la ecuación de la recta: y = 0,859x + 0,008, se pudo determinar el total de proteínas de cada extracto de hojas de Moringa procesadas. En la tabla I se visualiza el promedio obtenido para el caso de las tres muestras de hojas.

Tabla I Cantidad total de proteínas en extracto de hojas de Moringa oleiferaa partir de 0,25g de muestra

Extracto

Cantidad de proteína (μg)

Hoja1

12,10

Hoja2

6,74

Hoja3

8,75

Promedio

9,20

El caso de losextractos de flores, vainas jóvenes y semillas se presenta en la Tabla II.

Tabla II Cantidad total de proteínas en extracto de flores, vainas jóvenes y semillas de Moringa oleifera

Extracto(peso inicial)

Cantidad de proteína (μg/μL)

Semillas (0,5g)

1,96