UNIVERSIDAD AUTÓNOMA FACULTAD DE INGENIERÍA, PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA PRACTICA DE LABORATORIO NO 2 . EXTRACCION DE ADN.

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Completar a 100 ml con agua destilada estéril. Autoclavar .

Almacenar a 4ºC.

4.2Buffer de lisis celular (100 ml):

- 5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0

- 20 ml de SDS 10%

- 60 ml de agua destilada estéril

Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un Erlenmeyer hasta homogenización completa.

Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estéril.

No Autoclavar.

Almacenar a temperatura ambiente

4.3Solución precipitante de proteínas (50 ml):

- 38,54 g de Acetato de Amonio

- 10 ml de agua destilada estéril

Mezclar en un erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización.

Puede requerir calentamiento ligero.

Completar a 50 ml con agua destilada estéril.

Autoclavar

Almacenar a 4ºC.

4.4. Solución de rehidratación 10 ml

- TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM)

- Preparar TRIS 1 M pH 8.0 100ml PM 121.1g

- EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml

Y a partir de estos hacer la mezcla TE y dilución correspondientes

5. PROCEDIMIENTO

Realizar el siguiente protocolo:

1. En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este adicionar con una pipeta de transferencia plástica 2 mL de sangre total. Mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa homogenización.

2. Agitar fuertemente durante 7 minutos a temperatura ambiente.

3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos (no frenar la centrifuga).

4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.

5. Mezclar vigorosamente el pellet (vortex) en el líquido residual.

6. Adicionar 2.5 ml de buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente.

7. Adicionar 800 μl de solución precipitante de proteínas. Mezclar fuerte, hasta observar grumos de las proteínas precipitadas.

8. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos, sin freno.

9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga 2,4 mL

de isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al menos unos 5 minutos.

10. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el ADN.

11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol al 70% frío, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 μl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 μl etanol al 70%.

6. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1. Cuál es la diferencia entre los conceptos Hemoglobina y Hematocrito?

2. Cuál es la influencia de la Hemoglobina y del hematocrito en el color de la sangre?

3. Se puede inferir algo acerca del contenido de ADN de la muestra a partir del contenido de hemoglobina y/o de hematocrito?

4. De los elementos corpusculados de la sangre, cuáles sirven como fuente de ADN y porque?

5. El EDTA contenido en los tubos en los que se obtuvo la muestra, funciona como un a anticoagulante. Describa su acción en términos bioquímicos.

6. Cuál es la observación más notable después de incubar la muestra en RCLB y a que cree que se debe tal efecto?

7. Como es posible que RCLB y WCLB tengan efectos tan diferentes?. Explique los fundamentos bioquímicos.

8. Cuál es el fundamento bioquímico para que la solución PPB realice su acción?

9. Cuál es el fundamento bioquímico para que los ácidos nucleicos precipiten en presencia de Isopropanol?

10. En que se diferencian los efectos del isopropanol y del etanol sobre el ADN?

11. Que se espera del proceso de extraer el alcohol y adicionarle agua al ADN?

12. Cuál propiedad fisicoquímica permite este efecto?

13. Cuál es la vida media del ADN en las condiciones finales en que se deja después de esta práctica?

7. BIBLIOGRAFÍA

- Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene,Promega, Biorad, Biologend, Bioline, etc.

- David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecularbiology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986

- Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6Sons, 1988

- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2ndedition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

- Catálogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes