Estudio de la estructura celular al microscopio óptico

Determinación de la actividad enzimática y de la actividad específica de la fosfatasa ácida de germen de trigo

Introducción

La fosfatasa ácida de germen de trigo es una enzima que hidroliza fosfomonoésteres, liberando ortofosfato inorgánico. Esta enzima necesita un medio de reacción ácido (PH< 7) para cumplir su función catalítica, es así como a valores de PH básicos la enzima se desactiva, no cumpliendo su rol catalítico. En nuestro estudio utilizamos como sustrato enzimático el p-nitrofenilfosfato, para el cual uno de los productos de la reacción catalizada es el p-nitrofenol, el cual en su estado desprotonado nos brinda la posibilidad de obtener su concentración, mediante técnicas espectrofotométricas a 405 [nm]. La reacción catalizada por la fosfatasa ácida de germen de trigo se muestra en la Figura N°1:

[pic 2]

Figura 1 Hidrólisis catalizada por fosfatasa ácida

Donde “R” corresponde, en nuestro caso, a un grupo p-nitrofenil.

Podemos cuantificar el producto mediante la Ley de Lambert-Beer, la cual es:

A = c · ε · l                                                                              (1)

Donde “A” es la absorbancia obtenida espectrofotométricamente, “c” es la concentración molar del producto, “ε” es el coeficiente de extinción molar de la molécula y “l” es el ancho de la celda, en cm.

Para determinar que la reacción descrita se realiza enzimáticamente y no por otros medios, se realizaron algunas pruebas, tales como: blanco de sustrato, control no enzimático, tiempo cero; lo que nos permitió asegurarnos que la fosfatasa es la responsable de que la reacción ocurra.

Por otro lado, se calculó la actividad enzimática y la actividad enzimática específica de la fosfatasa para una incubación de 10 minutos.

Objetivos:

• Comprobar si la reacción de hidrólisis de p-nitrofenilfosfato es enzimática
• Calcular la actividad enzimática y la actividad enzimática específica en la reacción.

Resultados y análisis

Se prepararon soluciones por duplicado para realizar una curva de calibración de p-nitrofenol (p-NF) con los compuestos y proporciones indicados en la tabla 1.

Tabla 1: Muestras curva de calibración para p-nitrofenol

Se midió a absorbancia a 405 nm, calibrando con una solución de NaOH 0,1 M. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Datos para curva de calibración de p-NF

Se graficaron los puntos que mantienen la linealidad y se realizó una regresión lineal con el fin de obtener la ecuación que describa la relación de absorbancia y concentración de p-NF.

[pic 3]

Figura 2: Curva de calibración para p-nitrofenol

Tabla 3: Parámetros de la recta obtenida mediante regresión lineal.

Ecuación obtenida de la curva de calibración

[pic 4]

Utilizando la ecuación N°1 (Ley de Lambert-Beer) obtenemos el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenolato, entonces:

ε = 0,00264 [uM-1 · cm-1]

Posteriormente, se realizó una serie de ensayos para determinar la actividad enzimática de la reacción de p-nitrofenilfostato  con agua para formar p-NF. Para las incubaciones se utilizó un volumen total de 0,5 mL, luego de transcurrido el respectivo tiempo de cada incubación se agregaron 5,5 mL de NaOH 0,1 M, compuesto que detiene la reacción de la fosfatasa ácida y permite medir la absorbancia en igualdad de condiciones a las soluciones medidas para la curva de calibración (se completan los 6 mL)