TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRÍA

...

Control de linealidad fotométrica: Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección, y por ende el rango de utilidad de medida de instrumento. Para este control se debe trabajar con algún colorante en solución, que se sabe que cumple con la Ley de Lambert-Beer (presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración en el rango de trabajo utilizado) se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones crecientes del colorante utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de referencia certificadas. Si el equipo cumple con el control el gráfico de absorbancia experimental en función de absorbancia de referencia será lineal hasta el último valor de absorbancia experimental y éste último valor será el máximo valor de absorbancia aceptable para cualquier otra medida. Cuando no se dispone de los valores de referencia de absorbancias y sí se conocen las concentraciones de las soluciones a medir, se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de concentración a partir del cual también se podrá evaluar la linealidad fotométrica.

Control de veracidad fotométrica: A través de éste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una solución estándar de referencia medida en un equipo calibrado, y la absorbancia de la misma solución medida en el equipo que se está controlando. El control permite analizar la veracidad de los resultados obtenidos con el equipo controlado.

Control de la precisión fotométrica: Este control tiene como finalidad evaluar la repetibilidad de una serie de medidas de absorbancia obtenidas al realizar varias medidas de una misma solución. A mayor repetibilidad en la serie de datos, habrá mayor precisión o bien menor dispersión. Se utiliza una solución coloreada cuyo requisito básico es que su valor de absorbancia sea estable a través del tiempo.

Si disponemos de una sustancia conocida y queremos trabajar con ella para realizar una cuantificación debemos elegir la longitud de onda óptima de trabajo, la cual se selecciona teniendo en cuenta el espectro de absorción de la sustancia. Se prefiere un máximo de absorbancia, dado que así se obtiene mayor sensibilidad en las lecturas y hay que evitar trabajar en regiones del espectro donde hay cambios bruscos de absorbancia, ya que un pequeño desplazamiento en la longitud de onda puede causar un error grande en la correspondiente lectura.

En el trabajo práctico se realizó una reacción colorimétrica para determinar la concentración de proteínas totales presentes en una muestra (o solución incógnita), midiendo su absorbancia y la de soluciones testigo (que contienen al analito en una concentración conocida).

Cuando el analito no es coloreado se usa una reacción química, donde el color generado se debe a la reacción del analito con el reactivo (tal es el caso para proteínas con la reacción del Biuret); el reactivo debe estar en exceso para poder reaccionar con todo el analito presente en la muestra.

La presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no sean específicamente el analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia leída de dicho tubo; para esto se deben preparar otros tubos que los contengan para descontar dicha/s absorbancia/s ya que no corresponde/n al analito que se quiere medir.

Tubo de referencia o blanco de solvente: puede contener agua o el solvente que se utilice en la reacción y que estará presente en todos los tubos; contra este tubo se leerán todos los demás, es decir con él se llevará a cero de absorbancia y será la referencia.

Tubo blanco de reactivo: contiene todos los reactivos necesarios para que se realice la reacción, pero no contiene a la muestra o al testigo; por lo tanto la medida de absorbancia de éste será descontada a la del tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el valor de la absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, según corresponda.

Tubo blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra pero no al reactivo; se utiliza para medir la contribución de otros analitos o sustancias interferentes que estén presentes en la muestra y que no son el analito, la medida de absorbancia de este tubo también será descontada del tubo de muestra.

Tubo blanco de testigo: contiene al testigo pero no al reactivo; su absorbancia será descontado al tubo testigo.

En todos los casos se reemplaza el volumen de reactivo, muestra o testigo, por un volumen igual de solvente en el tubo según corresponda.

Para determinar el valor de las proteínas en una muestra desconocida, además de procesarla según indica el protocolo, se debe realizar una curva de calibración. Para esto una serie de testigos de distintas concentraciones, se procesarán de la misma forma que la muestra, se registrarán sus absorbancias y se graficarán los valores en función de sus correspondientes concentraciones, obteniendo así el gráfico de calibración. Esta relación deberá ser lineal porque las concentraciones de los testigos utilizados, están comprendidos dentro del rango de validez de la ley de Lambert - Beer. Si el valor de absorbancia correspondiente a la muestra incógnita se encuentra dentro de dicho rango se podrá obtener desde la ecuación de calibración, el valor de la concentración la misma.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Según guía de Trabajos Prácticos de Espectrofotometría Cátedra de Física, FFyB.

RESULTADOS:

Tabla: Control de luz espuria accidental

Transmitancia (%) +/- 0,1

Cubeta de medida

100

Cubeta de obstrucción

0,0

λ = (500 +/- 10) nm

Tabla: Control del volumen mínimo

Volumen (ml)

Absorbancia +/- 0,001

0,5 +/- 5,0 x 10-2

0,043

1,0 +/- 5,0 x 10-2

0,075

1,5 +/- 5,0 x 10-2

0,393

2,0 +/- 5,0 x 10-2

0,495