CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODOS DE BRADFORD Y MICROKJELDAHL

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El objetivo de la práctica se centra en comparar estos dos metodos de determinacion cuantitativa de proteínas, contenidas en una muestra de harina de haba, teniendo en cuenta factores como: sensibilidad, interferencia por sustancias no proteicas, rapidez y exactitud.

MATERIALES Y MÉTODOS

Al inicio de la práctica se preparó una mezcla utilizando la harina que fue asignada (haba); utilizando NaCl al 1% se llevó a cabo la centrifugación, posteriormente se realizaron las respectivas rotulaciones y se llenaron los tubos de ensayo de acuerdo a la tabla de la práctica usando la micropipeta, agregando claramente, el reactivo de Bradford, una vez terminado este proceso se midie[a]ron las absorbancias a una longitud de onda de 580 nm en el espectrofotómetro.

Por otra parte para la realización del método de microKjeldahl se tomó la misma muestra de habas, se le agregó muestra catalizadora y H2SO4, llevando esta mezcla al digestor se sacaron los tubos de Kjeldahl una vez listos y si tituló la muestra valiéndose de indicador Taschiro y HCl 0,0100 M, además de un blanco y una solución de triptófano previamente preparadas. A continuación se muestran los resultados de cada método de determinación de proteínas.[b]

RESULTADOS

Método de Bradford

En este método se presentan las absorbancias de proteínas medidas a 580 nm. Posteriormente se determina el % de proteína presente en cada muestra.

Muestra de harina de Haba

La tabla muestra los valores hallados por medio de la ecuación C1V1=C2V2, en la cual se despeja la concentración 2; teniendo en cuenta los valores conocidos utilizados a lo largo de la práctica; en el caso de las muestras problemas, se utiliza la ecuación de la recta resultante de la gráfica de la absorbancia vs. la concentración. Además de la concentración, se presenta la absorbancia de cada una de las soluciones luego de haberles restado el valor del blanco.

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Tabla 1. Absorbancia obtenida con respecto a la concentración de BSA y las muestras de harina de haba.

La gráfica representa los valores de la concentración de proteína presente en los tubos. En este caso se observa que los valores de absorbancia aumentan a medida que se incrementa el valor de la concentración; por lo cual esta gráfica presenta una trayectoria directamente proporcional.

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Gráfica 1. Relación entre la variación de la concentración y la absorbancia respecto a una longitud de onda de 580 nm.

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Determinación de la concentración de proteínas

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Cálculos del porcentaje de proteína en las muestras problema

Tabla 2. Porcentaje proteico de las muestras de harina de haba

Muestra 1

Tubo 8

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Tubo 9

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Muestra 2

Tubo 10[pic 10]

Tubo 11

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Método de microkjeldahl

Con este método se determinará la cantidad de nitrógeno total que se encuentra en dos muestras de harina de haba y en el triptófano; estableciendo también el porcentaje proteico presente en la muestra y cómo varía con respecto a la literatura.

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Tabla 3. Porcentaje de nitrógeno total y de proteína en las muestras

Muestra 1. Harina de haba

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Muestra 2. Harina de haba

Triptófano[pic 14][pic 15]

DISCUSIÓN

El método de Bradford consiste en la unión de un colorante conocido como Coomassie Blue G-250 a las proteínas. Dicho colorante en solución ácida tiene dos formas: una azul y una rojiza; la unión de las proteínas con la parte azul del colorante genera un complejo proteína-colorante, que tarda dos minutos en formarse y puede permanecer estable un máximo de 1 hora, teniendo una sensibilidad 4 veces mayor que en el ensayo de Lowry (Brito Arellano, 2010). En este método la intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos (Bradford, 1976). De acuerdo a las cantidades de BSA que se le administraron a los tubos en el método de Bradford, se reafirmó la relación directamente proporcional que existe entre la presencia de proteína y el nivel de absorbancia (Chromý et al., 2009).

En los resultados obtenidos con el método de Bradford se observa un coeficiente de correlación lineal cercano a 1 (ver gráfica 1), lo que indica que hay una relación lineal entre las dos variables; sin embargo, este valor no llega a ser uno, debido a que se pudieron presentar algunos errores en la toma del valor de la absorbancia. Al obtener las concentraciones de las muestras problema y posteriormente el % proteico (ver tabla 2), se observa que este valor es muy pequeño comparado con el valor literario, que corresponde al 26% (Mataix, 2005), lo que nos indica que a pesar que este método es muy sensible no permite la obtención de una gran cantidad proteica.

El método de Microkjeldahl permitió la determinación del porcentaje de nitrógeno bruto y neto presente en dos muestras de harina de haba; esto ocurre debido a que la muestra se destruye por oxidación con el ácido sulfúrico concentrado en ebullición, lo que hace que que el nitrógeno orgánico se separe y se transforme en nitrógeno amoniacal; dicha reacción depende en gran medida de la temperatura, debido a que el aumento de la misma acelera la oxidación y la aparición del sulfato de amonio. Luego, en el proceso de digestión la adición de una solución alcalina concentrada permitió la liberación de amoniaco gaseoso. En este proceso, el vapor de agua funciona como extractor de amoníaco (componente volátil) de la