DETERIORO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PATOGENOS DE ORIGEN ALIMENTARIO POR PCR

...

Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos:

Aunque menos desarrollada que la PCR, hay una serie de reportes en la literatura sobre los ensayos de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), incluyendo algunos que utilizan la metodología de tiempo real, para detectar ARNm de patógenos asociados a alimentos . Otros informes sobre el uso de esta tecnología para la detección de patógenos en alimentos se prevén con mucho interés, debido a su capacidad para detectar organismos viables.

Sin embargo, en un trabajo realizado por Rodríguez (2004) la sensibilidad del ensayo NASBA a tiempo real fue pobre, durante la detección de Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis (MAP) en muestras de leche artificialmente inoculadas. Se requirió más de 5×103 células, y la reacción tampoco diferenció el ARN del ADN, reduciendo así la ventaja principal del NASBA para la detección de células vivas solamente.

Electroforesis en gel de campo pulsado:

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) se ha utilizado para la caracterización de Salmonella, Listeria y otros patógenos de transmisión alimentaria.

Esta técnica se ha utilizado satisfactoriamente en la tipificación de Salmonella, aislada a partir de alimentos de origen animal y pacientes humanos. La PFGE también ha sido extensamente utilizada a nivel mundial para la vigilancia e investigación de los brotes de E. coli O157:H7, el trazado de las vías de transmisión y el rastreo de las fuentes de brotes de restaurantes, granjas, aguas contaminadas, animales, humanos, y/o equipos.

Un ejemplo de la utilidad de las técnicas moleculares, durante la investigación epidemiológica, se puede evidenciar en diversos brotes de ETA que por asociación estadística llegan a ser significativos cuando se utilizan estas técnicas.

Biosensores:

Varios métodos basados en biosensores se han aplicado exitosamente en la detección de patógenos alimentarios. Estos sensores se han desarrollado utilizando ADN, técnicas inmunológicas y péptidos de fagos.

El uso de biosensores en un estudio demostró que la Escherichia coli y Salmonella podrían detectarse en leche descremada, con límites de detección de 25 y 23 UFC/mL respectivamente. El ensayo se llevó a cabo en un tiempo menor a 1 h. Los biosensores ópticos que utilizan una señal fluorescente son con frecuencia los más comunes. Sin embargo, los biosensores que utilizan transductores distintos a los ópticos se han desarrollado para la detección específica de Salmonella. Olsen et al., (2006) utilizaron bacteriófagos específicos para Salmonella typhimurium. En este biosensor, la captura de las bacterias por parte de bacteriófagos adsorbidos a un transductor piezoeléctrico dio lugar a un cambio de frecuencia en la resonancia, la cual fue medida con un dispositivo de onda acústica. Maxtek et al., (2005) utilizaron un anticuerpo enlazado a la superficie de un cristal de cuarzo recubierto con oro, con un electrodo de oro como biosensor. Después de la captura de Salmonella, los cambios en la impedancia de alta frecuencia fueron directamente relacionados con el número de células de Salmonella capturadas. Pathirana et al., (2000) y Kim et al., (2003) también utilizaron un análisis de impedancia similar para crear biosensores útiles en la detección de Salmonella typhimurium. Por otro lado Farabullini et al., (2007) utilizaron sensores electroquímicos para la detección rápida de diferentes bacterias patógenas transmitidas por alimentos (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, y Staphylococcus aureus).

Microarreglos:

Los microarreglos consisten en un gran número de sondas (clones de ADN, productos de la PCR u oligonucleótidos sintéticos) inmovilizadas sobre una superficie sólida. Tras los pasos de hibridación y lavado, el ácido nucleico enlazado a las sondas genera un patrón de fluorescencia que es entonces registrado y analizado utilizando un escáner. Con el rápido desarrollo de la tecnología de microarreglos se ha producido una acumulación de datos sin precedentes, recogidos por instituciones académicas y organizaciones industriales. Varios microarreglos se han desarrollado para los patógenos asociados a alimentos. Un microarreglo particular, basado en el gen gyrB, fue utilizado para detectar e identificar rápidamente a Salmonella y Shigella. Las diferentes especies de Listeria también han sido discriminadas por el uso de un microarreglo basado en seis genes de virulencia determinantes.

Algunos progresos se han hecho con la identificación de patógenos de alimentos a partir de ADN genómico utilizando microarreglos. La identificación molecular por microarreglos se ha demostrado para E. coli O157: H7 y Yersinia a partir de cultivos, tras la amplificación por PCR de los genes blanco. En el caso particular de este último microorganismo, la detección e identificación fue realizada en muestras de leche completa pasteurizada adulterada, utilizando este enfoque.

Un ensayo que incorporaba señales de amplificación y la tecnología de microarreglos en suspensión fue reportado para la identificación y subtipificación de Listeria monocytogenes a partir de ADN genómico. Arreglos de microperlas han sido desarrollados para la identificación de Salmonella spp. Una PCR múltiple, para E. coli O157: H7 y Salmonella combinada con un sistema de microarreglos en suspensión mostró una elevada sensibilidad para ambas especies.

Wang et al., (2008) presentó un ensayo basado en arreglos para la identificación de 23 patógenos transmitidos por alimentos. Su arreglo fue diseñado para hibridar al gen 16S del patógeno blanco. Los autores encontraron una reactividad cruzada, esperada de manera teórica. Sin embargo, esta reactividad cruzada no obstaculizó la clasificación correcta del aislado, debido a los patrones de hibridación específica de los patógenos.

Wondwossen (2007) desarrolló microarreglos de oligonucleótidos para la detección rápida, el diagnóstico y la caracterización de bacterias patógenas (Campylobacter, Salmonella y Yersinia) y virus (Norovirus) más importantes presentes en la carne de cerdo. Este autor realizó la comparación entre dos microarreglos, cuyas diferencias se basaron en el diseño de la sonda, el montaje y la conformación de la sonda en la lámina de vidrio. Los resultados obtenidos indicaron que los microarreglos empleados pueden identificar un amplio rango de bacterias patógenas y ayudar a la caracterización de la resistencia antimicrobiana y los genes de virulencia presentes,