Datos SepsiTest PRUEBA DE DETECCIÓN DE SEPSIS POR PCR E IDENTIFICACIÓN DE PATOGENOS POR SECUENCIACIÓN

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Correr con el siguiente programa F1: (run), Programa: Molzym 01, F1:Stara (Vol 25µl, velocidad Max, Vol. 5 a 100µl, F1: (Start).

96ºC---------- 4 minutos

a 94º C por 5 seg, 55 ºC por 5 seg, 72 ºC por 25 seg.

Nota: 40 ciclos.

Al terminar los ciclos de PCR almacene las muestras a 4 °C por 1 día, para mayor tiempo de almacenamiento a (-20ºC).

- Tiempo de amplificación 3 horas.

- DETECCIÓN EN GEL DE AGAROSA.

LAB 3

Placas deAgarosa al 2%.(E-GEL BrEt Marca Invitrogen) colocar el gen en la cámara de electroforesis (E-Gel iBasePowerSystem marca Invitrogen) darle un Pre-Run, posteriormente coloque en la posición del marcador, 15 ul de agua (libre de DNA) y 5 ul de Marcador DNA de 100 pb. Así como también coloque en el pozo correspondiente las muestras de bacterias, levaduras y control interno 12 ul de agua (libre de DNA) y 8 ul de muestra. Correr (run) durante 15 min.

Identifique los productos de PCR positivos para Bacterias (460 pb) y Levaduras (310 Pb) y proceda a purificarlos.

- Tiempo de Detección 40 min.

- PURIFICACION DE PRODUCTO DE PCR.

PureLink PCR Purification (Kit marcainvitrogen)

LAB 3

(Volumen mínimo de producto PCR 17 ul)

Preparación de reactivos:

Buffer (B3) Binding Buffer HC (23 ml) adicione al frasco 2.3 ml de isopropanol grado analítico, queda listo para su uso.

Buffer (W1) Wash Buffer (8 ml) adicione 32 ml de etanol grado analítico, queda listo para su uso.

Buffer (E1) Elusión Buffer (15 ml), listo para su uso.

Procedimiento:

Prepare dilución de producto de PCR.

Bacterias y levaduras: 1 volumen de producto de PCR (17ul) + 4 volúmenes (68 ul) de Buffer B3 (Buffer de enlace).

Identifique cada columna con el número de muestra correspondiente.

Pase a las columnas de separación el total de volumen del producto de PCR diluido de cada muestra.

Centrifugue por 30 seg a 13000 rpm.

Decante el líquido del tubo colector y coloque nuevamente la columna en su interior.

Adicione225 ulde buffer W1 (Wash Buffer).

Centrifuge30 seg a 13000 rpm.

Decante el líquido del tubo colector y centrifugue una vez más 2min.a13000 rpm.

Transfiera la columna a un tubo de elusión de 1.5 ml. Adicione en el centro de la columna y sin tocar la membrana 25ul de Buffer E 1 (Buffer de elusión).

Incubar la columna 1 min. atemperatura ambiente y centrifugar 2 min. a 13000 rpm.

Descartar la columna y tapar el tubo de elusión. Almacene el producto de PCR purificado en congelación (-20 °C).

- Tiempo de Purificación 40 min.

- REACCCIÓN DE SECUENCIACIÓN

Las muestras para la Reacción de secuenciación deben encontrarse previamente purificadas.

Pasos para preparar la reacción de secuenciación.

Mezcla maestra para 1 Reacción.

Kit Big DyeApplied Biosystems (AB)

0.5 µL

Primers 10mM (Bacteria+ 16S; Bacteria – 16S y Levadura 18S) “Molzym”

1.0 µL

Buffer 5x MgCl2 (AB)

1.0 µL

Agua libre de DNA

1.0 µL

Muestra DNA 10-20ng totales

2.5 µL

Total de reacción

6.0 µL

Añadir para el Control positivo 1 µL de PGEM, 1 µL de su respectivo primer, H2O, BDT y Buffer 5x. Para un total de reacción de 5 µL.

- Colocar la reacción en placas de 96 pozos en el equipo GeneAmp PCR System 9700 ABI, usar el programa ‹‹ pe ›› runBig DyeTM.

- Paso importante: Cubrir la placa con Clear Adhesive Film MicroAmp perfectamente con la ayuda de una espátula de plástico y colocar Compresión PadsOpticalCover para que no sé evaporen las reacciones.

- Si no se tiene instalado el programa introducir la rampa:

[pic 1][pic 2]

[pic 3][pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13][pic 14][pic 15]

45 Ciclos (tiempo de secuenciación aprox. 3hrs.)

- Reacción de secuenciación 3 horas.

Nota: Si las muestras no se van a purificar el mismo día, almacenar la placa a -20°C cubriéndola conClear Adhesive y aluminio.

- Darle un Spin/Centrifugar.

- Posteriormente purificar las muestras con Big DyeTMXterminator (ABi) agregar a cada pozo que contenga reacción.

Buffer SAM

27 µL

Big DyeTMXterminator

6 µL

Nota:Vortexear continuamente el Big DyeXterminator para homogeneizar, resuspender el Buffer con una pipeta, ya que tiende a formar espuma.

- Centrifugar/spin

- Sellar