Describa las técnicas de purificación utilizadas en el artículo escogido por el grupo y explique el fundamento científico de cada una de ellas..

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Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pH, temperatura y fuerza iónica; además, puede ser preparado de forma rápida y reproducible. Los geles que forma son insolubles en agua, con estabilidad mecánica, relativamente no iónicos y permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado y tiene la ventaja de que al variar la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. . (Antonio, 2008).

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). En el primer caso, las proteínas mantienen su estructura tridimensional y las diferentes cadenas poli peptídicas pueden permanecer unidas, separándose no sólo en función de su carga eléctrica, sino también según su tamaño y forma. Como su propio nombre indica, en el segundo tipo, y no en el primero, se incluyen agentes desnaturalizantes: reductores, detergentes y caótropos. Cuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS, éste se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena poli peptídica. Como media, se une una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos. La SDS-PAGE es un método mucho más resolutivo que la electroforesis en condiciones nativas; sin embargo, debido a que las proteínas se desnaturalizan, es imposible detectar actividad enzimática. : (Maldonado, A & Jorrín, J. 2006)

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Fuente: (Maldonado, A & Jorrín, J. 2006)

Figura 1. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida. Estructura del SDS. El tratamiento de las muestras con agentes desnaturalizantes provoca la desnaturalización de las proteínas, pérdida de la estructura secundaria y la disociación de las subunidades. Las proteínas quedan cargadas negativamente y migran del polo negativo al positivo durante la electroforesis.

El agente reductor de puentes bisulfuro, como el betamercaptoetanol (βME) desnaturaliza las proteínas y las rompe en las subunidades que la componen, Al romper los enlaces disulfuro se asegura que la proteína está completamente desnaturalizada y de ese modo se garantiza que correrá de manera uniforme en el gel. Por lo que el complejo SDS-proteína tiene generalmente mayor densidad de carga y menor tamaño que las proteínas nativas (García, H. 2001).

- Uno de los métodos más utilizados para el rompimiento celular es la sonicación, describa y explique el fundamento físico de esta técnica.

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La sonicación es un procedimiento en el cual se aplica energía (ultrasonidos) para agitar las partículas de una muestra, La sonicación es el proceso de convertir una señal eléctrica en una vibración física que puede ser dirigida hacia una sustancia. Los sonicadores son equipos vitales de laboratorio y se utilizan para muchos propósitos. La sonicación se realiza generalmente para separar compuestos o células para su examen más detallado. La vibración tiene un efecto muy poderoso en las soluciones, haciendo que sus moléculas se separen y las células se rompan. Un primer ejemplo está en las pruebas de ADN, donde las células que pueden contener información del ADN son sometidas a la sonicación para poderlas romper para que así liberen las proteínas del ADN para poder ser probadas. (Lacoma, T. s.f)

- Si se tiene 54 ml de extracto enzimático para realizar una purificación de proteínas, ¿Cuánto sulfato de amonio (NH4)2SO4 hay que adicionarle a dicha solución para llevarla a una saturación del 40%, y cuanto hay que adicionarle de más para llevarla al 70%.

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Tabla 16. Sulfato de amonio requerido para la precipitación de una proteína.

Esta tabla muestra la cantidad requerida de sulfato de amonio (NH4)2SO4 para llevar una solución de 1 litro con una concentración inicial de saturación, a una final a cero (0) °C

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Fuente: Capítulo 5. Tecnología enzimática. Módulo Biotecnología Alimentaria. UNAD. Pág. 125-126.

- La tabla nos indica la cantidad de amonio en (g) requerido para adicionar a 1L(1000ml) de solución a un porcentaje de saturación de 40% esta seria de 226g, pero como tenemos una cantidad de 54ml debemos determinar el dato de sulfato de amonio a adicionar:

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La cantidad de sulfato de amonio que debemos agregar a 54 ml de extracto enzimático para llevarla a una saturación del 40% es 12,204g [pic 14][pic 15]

- Ahora nos solicita cuanto debemos agregar de sulfato de amonio para llevar de 40% a 70% de saturación, esta sería 184g x L[pic 16]

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La cantidad de sulfato de amonio que debemos agregar a 54 ml de extracto enzimático para llevarla a una saturación del 70% es 10,098g [pic 18][pic 19]

- La enzima β-galactosidasa (EC.3.2.1.23) hidroliza el disacárido lactosa (Lac) (β-D-galactopyranosyl (1→4) α-D glucopyranosa) en sus dos monosacáridos Glucosa (G) y galactosa (Gal); la actividad enzimática de la β-galactosidasa, se ve inhibida por la presencia de fenol en el medio. Un estudio cinético, arroja los datos mostrados en la tabla 4. Con base en esto determine:

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- Los valores de la velocidad máxima (Vmax) y la constante de Michaelis (Km), por el método de Lineweaver Burk, Langmuir y Eadie Hofstee.

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Figura 1. Relación actividad enzimática (U) β-galactosidasa producida por el microorganismo Kluyve romice fragilis con respecto a la variación de sustrato en ausencia y presencia de fenol.

- Actividad enzimática 0,0 mM fenol método Lineweaver Burk

Datos

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Ecuación de grafico