Digestión de pDEST-32 con EcoRI y HindIII a partir del aislamiento y purificación del plásmido..

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Metodología.

Consultar “Manual de prácticas de Genética Molecular” revisión de enero 2016, páginas: 55-56, 63.

Observaciones, resultados y discusión.

A partir del crecimiento de Escherichia coli con antibióticos (gentamicina y ampicilina) se generaron plásmidos con genes de resistencia a estos, en este caso el plásmido vector pDEST32; ya que este es material genético de la bacteria. Para su extracción fue necesaria la lisis celular a partir del uso de lisozima para fragmentar las paredes en un medio adecuado para evitar la acción de DNAsas y asegurar el nutrimento y condiciones óptimas de pH, lo cual se logró mediante la acción del EDTA, glucosa y Tris respectivamente. Seguida de la lisis celular, se dio paso a la adición de sustancias alcalinas, las cuales al elevar el pH del medio interrumpieron el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separare, mientras que por el contrario, la configuración superenrrollada del plásmido se mantuvo estable; ya que de todos los elementos que conformaban a la bacteria, nuestro interés se enfocó en los plásmidos. Los restos celulares y posibles sales contaminantes se eliminan con la adición de una solución de acetato de amonio, este paso se llevó a cabo con cierto cuidado para evitar las interferencias por contaminantes en el corrimiento electroforético posterior. Además de lo mencionado con anterioridad, la precipitación del DNA plasmídico con el uso de etanol y la adición de RNAsas para digerir los restos de RNA de la muestra, nos aseguraban tener al plásmido altamente puro y para comprobarlo se llevó a cabo su cuantificación mediante espectrofotometría, los resultados obtenidos se muestran a continuación:

Tabla 1: Resultados obtenidos por equipo de la concentración del plásmido obtenidos por espectrofotometría, mostrando su relación 260/280.

Equipo

Concentración (ng/uL)

Relación 260/280

1

2100.96

2.007

2

381.544

1.786

3

1058.75

1.998

4

515.914

1.979

5

1817.84

2.098

6

495.05

1.739

7

461.918

1.906

8

445.749

1.886

Relación 260/280=1.7-1.9; Si el valor cae dentro de este rango se considera una muestra de DNA pura.

Las concentraciones a las que refiere la tabla anterior fueron obtenidas por los distintos equipos. Cabe destacar que a pesar de haber realizado la misma metodología se obtuvieron distintas en un rango de 381.544 ng/uL a 2100.96 ng/uL y con purezas variables, determinadas por la relación 260/280 que hace referencia al cociente de absorbancias a una longitud de onda de 260 nm entre la longitud de onda 280 nm; una relación 260/280 baja hace referencia a contaminación con proteínas, y al ser mayor de los valores de referencia, nos indica que la contaminación es con RNA, el cual en la siguiente imagen está representado por la letra A y es debido a que la cantidad de RNAsas fue insuficiente para digerirlo todo, o bien restos de los reactivos utilizados para la extracción como lo es el acetato y las sales, que también son interferentes (Hernández, O., Debesa A., Quesada, L., 2008); a pesar de ello se logró realizar la fragmentación del plásmido y los resultados de esta digestión se observan en la siguiente imagen.

Imagen 1.Electroforesis en gel de agarosa 0.7% revelado con GelRed de la digestión del plásmido pDEST32 con EcorRI y con HindIII

[pic 4]

MPM=Marcador de peso molecular; P= Plásmido; PDE= Plásmido digerido con EcoRI; PDH= Plásmido digerido con HindIII; PDEH= Plásmido digerido con EcoRI y HindIII; Números del 1 al 8= Equipo; A=RNA; B=Topoisomero lineal del plásmido; C= Topoisomero superenrollado del plásmido; I=Topoisomero circular relajado del plásmido; D=Fragmento de 5137 pb del plásmido; E: Fragmento de 3779 pb del plásmido; F=Fragmento de 2282 pb del plásmido ; G= Fragmento de 1068 pb del plásmido; H= Plásmido lineal producto del corte con HindIII; J= Fragmento de 5137 pb del plásmido, K= Fragmento de 3779 pb del plásmido, L= Fragmento de 3350 pb del plásmido., ACET: barrido contaminación con acetato.

La digestión de un plásmido se lleva a cabo utilizando nucleasas, también llamadas enzimas de restricción, que realizan cortes en el plásmido en puntos específicos generando fragmentos de tamaños constantes (Suárez, O. et all. 2004); no se puede realizar con el plásmido sin digerir ya que como lo muestra la imagen anterior se forman topoisómeros, que aunque sean del mismo tamaño, no corren de la misma forma debido al enrollamiento que presentan y podemos obtener un tamaño erróneo.

La enzimas utilizadas fueron EcoRI y HindIII, estas enzimas cortan a pDEST32 en sitios únicos; EcoRI lo corta tres veces en los sitios 2625, 6404 y 11541, mientras que HindIII solo lo corta una vez en el sitio 1557. (Thermo Fisher Scientific Inc., 2015); teóricamente los fragmentos generados con la enzima EcoRI son de tres tamaños diferentes el primero es de 5137, el segundo es de 3779 y el último es de 3350, marcados con las letra J, K y L respectivamente en la imagen anterior. Se hizo este cálculo utilizando la herramienta NEBcutter, obteniendo los tamaños de los fragmentos que teóricamente se deben obtener. Los cortes con EcoRI fueron considerados como si la enzima realizara los tres cortes, porque en la posición 6403 puede ocurrir una metilación en la base nitrogenada impidiendo que EcoRI realice el corte.

Imagen