Disminuicion receptores v2

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AQP2 renal, y estos efectos combinados contribuyen a la capacidad de concentración urinaria disminuida en ratas de edad avanzada. Para poner a prueba nuestra

hipótesis, utilizamos ratas híbridas de Fischer 344 (F344) y Brown-Noruega F1 (F344BN), desarrolladas por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) para la investigación del envejecimiento, que viven mucho más tiempo y tienen menos patología renal en cualquier edad en comparación con otras cepas puras (26, 49). De particular importancia para estos estudios, la rata F344BN tiene una incidencia significativamente menor de procesos patológicos renales que sus ratas F344 padres y otras razas (26). En el presente estudio,la capacidad de concentrar la orina, los niveles de AVP plasmáticos, la expresión renal de ARNm V2R, y la abundancia de AQP2 renales se midieron en ratas F344BN varones de diferentes edades en condiciones basales y en respuesta a una restricción moderada de agua.

M A T E R I A L E S Y M E T O D O S A N I M A L E S .

Ratas F344BN varones en edades de 3 meses (joven), 10

meses (adultos) y 24 meses (a principios de edad) se obtuvieron del NIA. Las ratas fueron alimentadas con el NIH-31 / NIA dieta fortificada (18,74% de proteína como la harina de pescado y harina de soja), mientras maduraban en el NIA. Mientras eran mantenidos en la Universidad de Georgetown, todos los animales fueron alojados en las instalaciones de cuidado de los animales en un 12:12 horas ciclo de luz-oscuridad y se alimentaron con comida para roedores de laboratorio estándar (sin dieta de 5001, 23.4% de proteína como la harina de pescado y harina de soja, LabDiet. , St. Louis, MO) y agua ad libitum ( a gusto).

P R O T O C O L O S D E E N S A Y O S C O N A N I M A L E S . Para los estudios realizados en condiciones basales, a

las ratas se les permitió el libre acceso a pellets de comida para rata (no. 5001 dieta, LabDiet) y agua. Para los estudios de restricción de agua, ratas en cada grupo de edad se dividieron en subgrupos de control y restringida de agua. Las ratas de control recibieron agua ad libitum, mientras que las ratas con restricción de agua se les dio sólo el 25% de la ingesta diaria de agua de las ratas control. A todas las ratas se les dio libre acceso a comida para ratas peletizado. Las ratas se mantuvieron en jaulas metabólicas para permitir la recogida diaria de orina para la medición de la osmolalidad de la orina y la concentración de sodio. El

peso corporal y la ingesta de agua también se midieron diariamente. Después de 5 días de restricción de agua moderada, todas las ratas se sacrificaron por decapitación. Ambos riñones fueron retirados rápidamente, se enjuagaron con tampón PBS enfriado con hielo, y se procesaron para estudios adicionales.

M O R F O L O G Í A D E L R I Ñ Ó N .

Los riñones se retiraron y se fijaron por inmersión con

PBS-4% de paraformaldehído durante 4 h y luego en

75% de etanol durante la noche a temperatura ambiente. Los tejidos fueron incluidos en parafina y se cortaron en secciones de 4 micras en el Departamento de Patología del Hospital Universitario de Georgetown. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (para examen morfológico general) y de la mancha de ácido periódico de Schiff (para la demostración de los depósitos de glucógeno) (50). Los cambios morfológicos fueron evaluados por análisis visual utilizando microscopía de luz.

I N M U N O H I S T O Q U Í M I C A .

Los riñones se seccionaron como se menciona anteriormente. Las secciones se preincubaron en 10% de suero normal de cabra durante 20 min a temperatura ambiente y luego se incubaron en PBS / BSA (1%) que contiene el anticuerpo primario generado contra AQP2 (n. ° 751) durante 1 h. Después se lavaron tres veces durante 10 min en PBS, las secciones fueron incubadas en 6% de H2O2 durante 10 min y después se incubaron con un segundo anticuerpo (IgG anti-conejo, Vector, Burlingame, CA) durante 1 h. Las secciones se lavaron de nuevo y después se incubaron en una solución de B / (Vector). Las secciones teñidas se analizaron visualmente utilizando microscopía de luz (aumento original × 400).

P L A S M A Y O R I N A O S M O L A R I D A D Y M E D I C I Ó N D E L A C O N C E N T R A C I Ó N D E S O D I O .

Orinas de veinticuatro horas se recogieron diariamente utilizando jaulas metabólicas. Sangre del tronco se recogió en el momento de la decapitación. La orina y plasma osmolaridad se midió utilizando un Instrumento Osmómetro Avanzado (modelo 3900, Instrumento Avanzado).

M E D I C I Ó N D E P L A S M A A V P .

Radioinmunoensayo AVP se realizó por duplicado después de la extracción de acetona-éter de plasma usando un anticuerpo anti-AVP desarrollado en nuestro laboratorio (43). La curva estándar AVP es lineal entre 0,5 y 10 pg / tubo, y la concentración mínima detectable AVP en el plasma extraído es 0,5 pg

/ ml.

R E N A L M E D I C I Ó N V 2 R M R N A .

El ARN total fue extraído de medulas interiores renales (IM) utilizando Trizol. Los tejidos fueron homogeneizados 2 × 10 s en 1 ml de TRIzol por IM renal usando un homogeneizador rotatorio (Agitador StedFast, modelo SL 1200, Fisher Scientific). La pureza y la concentración de ARN fueron evaluados por espectrofotometría y 10 g de ARN total de riñón fueron cargados en cada carril. La intensidad y la calidad de las bandas ribosomales 18s y 28s fueron evaluados para ambas diferencias cualitativas y cuantitativas en las muestras de ARN. Las muestras se procesaron en geles de agarosa 1% que contienen formaldehído. La transferencia de ARN a membranas de nylon cargada positivamente (Boehringer Mannheim) se realizó durante la noche por la acción capilar de 20 x SSC buffer(NaCl 3,0 M, 0,3 M de citrato de sodio). La sonda específica marcada para el V2R fue sintetizada por transcripción inversa de mRNA total de riñón seguido por PCR usando un kit de síntesis de sonda PCR DIG (Boehringer Mannheim). La secuencia de los cebadores V2R se informó anteriormente (22). Las transferencias se probaron utilizando métodos estándar (lavado DIG y juego de tampones bloque y un kit de detección luminiscente