Eficacia de desinfectantes basados en cítricos para inhibir el crecimiento, swarming, formación de biopelicula de Salmonella y descontaminación de perejil

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Material y Métodos

Los cultivos bacterianos: Salmonella Typhi ATCC 19430, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se obtuvieron originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Las siguientes cepas bacterianas fueron aisladas en nuestro laboratorio: Salmonella Muenchen M59410 (de heces de pollo), Salmonella E1 monofásica (de perejil), y Salmonella spp. (De pollo crudo). Estas cepas se identificaron utilizando el sistema Biolog (Hayward, CA), confirmado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el serotipo en el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica de México (INDRE). Todas las cepas se almacenaron a - 80 ° C en agar infusión cerebro corazón (BHI) (Difco) que contiene 20% (v / v) de glicerol. Los cultivos activos se prepararon mediante la inoculación de una alícuota en caldo BHI y se incubaron a 37 ° C durante 48 h. Una alícuota de esta se extendió sobre (MH) agar Mueller-Hinton (Difco) y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Las colonias se suspendieron en solución salina y se ajustaron a 1,5 × 108 UFC / ml.

Antimicrobianos basados ​​cítricos utilizados: En este trabajo se utilizaron seis desinfectantes comerciales. Citrik AB líquido, Citrik AB en polvo se utilizan para el uso general en la industria alimentaria, Citrodex se utiliza para la desinfección de superficies, Citrol K Ultra se utiliza para el uso general en la industria alimentaria, Citrik Max se utiliza para el uso de granja, y Citrik Agro se utiliza para la desinfección de los productos agrícolas, utensilios e instalaciones. Todos los desinfectantes se obtuvieron de Corpo Citrik, SA de CV, México. De acuerdo con las especificaciones técnicas, estas formulaciones se basan en extractos cítricos "generalmente reconocidos como seguros" (GRAS).

Concentración mínima bactericida (CMB): Placas U-microtitulación estéril de poliestireno de 96 pocillos (BD Falcon, San José, CA) se llenaron con 50µl de 2× caldo MH (Difco), y 50 µl de diferentes concentraciones de los productos comerciales (diluido en agua destilada) fueron probados 13, 14. Las placas se inocularon con 1µl (1% v / v) del cultivo de cada cepa activado o un grupo de cinco cepas de Salmonella (1,5 × 108 UFC / ml) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de la incubación, el contenido de cada pocillo se sembró en agar MH y se incubó a 37 ° C durante 48 h. La CMB se consideró como la concentración más baja del producto que impedía cualquier crecimiento visible de colonias bacterianas (ausencia total de colonias) en la placa de agar MH después del período de incubación de 48 h. Se llevaron a cabo experimentos separados para determinar el efecto de los desinfectantes (CMB) en el pH del caldo de MH.

Ensayo cuantitativo de biopelícula: placas de U-microtitulación de poliestireno estéril de 96 pocillos (BD Falcon) se llenaron con 150µl de los productos comerciales a diversas concentraciones diluidas en agua destilada (100, 75, 50, 25 o 0% de la CMB, concentración final) más 150µl de 2× de caldo de soya tripticasa que conteniendo 2% de glucosa y cloruro de sodio al 2%. El medio se inoculó con 3µl de un cultivo de Salmonella activa (1,5 × 108 UFC / ml). Las placas se incubaron durante 24 h a 37 ° C. Después de eso, se eliminó el cultivo, y las placas fueron lavadas dos veces con agua destilada, se dejaron secar durante 24 h. Después, se añadieron 200µl de safranina 0,1% a los pocillos y se incubaron durante 3 min. La placas se lavaron dos veces, se añadieron 200µl de etanol al 95%, y se registró la absorbancia (492 nm) 15.

Medio de cultivo con cada desinfectante a diversas concentraciones y medio solo se utilizaron como controles.

La formación de biopelículas se cuantificó mediante la determinación del índice de la formación de biopelículas (IBF) obtenido a partir de la fórmula: IFB = (AB - CW) / G 16, donde AB es la densidad óptica del microorganismo adherido tenido, CW es la densidad óptica del pozo control teñido conteniendo microorganismos libres solo en el medio, y G es la densidad óptica de la crecimiento de las células en suspensión en cultivo. Según los valores BFI, la formación de biopelículas se consideró fuerte (> 1,10), moderada (0,70 a 1,09), débil (0,35 hasta 0,69), y no hay formación de biopelículas (

Efecto en Swarming: Placas swarming fueron usadas para probar la capacidad de los desinfectantes para inhibir a las células para extenderse sobre la superficie del agar. Los desinfectantes a diversas concentraciones (75, 50, 25 y 0% de sus respectivos CMB) se mezclaron con agar Luria Beltrani líquido previamente esterilizado (0,5% de agar). Para promover la motilidad Swarming, se añadió glucosa a una concentración final de 0,5% y se vertió en una placa Petri. Después de estar a temperatura ambiente, se añadieron 5µ l del cultivo activo (1,5 × 108 UFC / ml) en el centro de la placa solidificada y se incubaron durante 18-24 horas a 37 °C. Finalmente, se midió el diámetro de la colonia, en comparación con el control (0% desinfectante) y se determinó el porcentaje de reducción

Descontaminación de perejil: A partir de los desinfectantes analizados, Citrik Agro fue elegido en este ensayo debido a su uso previsto para desinfectar hortalizas. Para evaluar la eficacia de Citrik Agro en la descontaminación de perejil, el método descrito por Foley et al. 17 se realizó con modificaciones menores.

Preparación de los inóculos: Un asa de siembra de cada cepa activa crecida en agar BHI se inoculó en tubos separados con 10 ml de caldo de soya trípticasa (TSB, Difco) y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Las células se recogieron por centrifugación (3000 x g, 10 min a temperatura ambiente), el sedimento se resuspendió en 1% de agua de peptona, y la concentración se ajustó a 1 × 105 UFC / ml. Una alícuota (1 ml) de cada cepa en suspensión se combinó, y esta se utilizó para inocular el perejil.

Inoculación de perejil: Perejil fue adquirido de los mercados locales y se almacenó a 4 ° C durante un máximo de 24 h antes de su uso. Para determinar en contenido inicial de Salmonella spp. En el perejil, las muestras se sometieron a análisis microbiológicos (presencia de Salmonella spp.) de acuerdo con protocolos de US-FDA Manual de Analítico bacteriológico 18. Si se detectaba Salmonella spp. en las muestras, los ensayos fueron descartados.

Para los ensayos, las muestras perejil se lavaron suavemente con agua corriente del grifo seguido de enjuague suave en agua destilada estéril y secado a temperatura ambiente durante 2 h en una cabina de bioseguridad de clase II (Labconco, Kansas City, MO). Perejil lavado (60 g) se sumergió