Eficiencia de la extracción de ADN total para dos sepas bacterianas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa

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Fotografía 4. Calentando en el microondas el agar puesto en el buffer TBE. 15

Fotografía 5. Poniendo el bromuro de ètilo en el la solución de agar y buffer TBE. 16

Fotografía 6. Vaciando el agar sobre el molde para el gel de electroforesis. 16

Fotografía 7. Cámara de electroforesis y sus electrodos. 17

Fotografía 8. Fuente de poder para la electroforesis. 17

Fotografía 9. Nanodrop 2000. 18

Fotografía 10. Interfaz del programa 18

RESUMEN

El área donde se realizó la presente práctica fue en las instalaciones del CIRNA, en las unidades especializadas de microbiología y biotecnología, todo ubicado en San Lorenzo, Distrito de Belén, Provincia de Maynas, Departamento de Loreto. La misma se desarrolló en el transcurso del tiempo de dos meses entre los meses de febrero y marzo, el objetivo del estudio fue determinar la eficiencia del método de extracción de ADN total por choque térmico para Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, para lo cual utilizamos el método de choque térmico que consistía en congelar la muestra bacteriana durante 30 minutos y luego someterla a ebullición por unos 15 minutos, para luego centrifugar y rescatar el sobrenadante, guardándolo a -20ºC, después se analizó la muestra por electroforesis y el análisis espectrofotométrico se hizo con el nanodrop 2000. La eficiencia del método no es muy buena ya que la lectura de la muestra en nanodrop mostro cierta contaminación por resto celulares y proteínas desnaturalizadas que se produjeron en la ebullición de la muestra, sin embargo tenemos que este método es sencillo y menos costoso ya que no usa de reactivos caros y tóxicos y tanto el ADN bacteriano de las G+ y G-, siendo ligeramente mejor en las G+, puede ser utilizado en un análisis para la identificación de la sepa por PCR.

Palabras claves: choque térmico, ebullición, electroforesis, espectrofotométrico, nanodrop, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus

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I. INTRODUCCIÓN

Las infecciones nosocomiales representan un problema muy importante en la salud publica ya que no solo afectan a la salud de la comunidad si no que trasciende en los ámbitos económicos y sociales. Además de ser un gran desafío para las instituciones de salud y el personal médico responsable de su atención en las unidades donde se llegan a presentar, son de importancia clínica y epidemiológica debido a que condicionan altas tasas de morbilidad y mortalidad, además de tener un gran incremento en los días de hospitalización, así como los costos de atención.1 Uno de los principales problemas asociados con estas enfermedades es la aparición de resistencia a los antibióticos de uso común, debido principalmente a su abuso e inadecuada utilización, generando microorganismos multirresistentes, importantes repercusiones tanto en los pacientes como en los sistemas de salud, así como aparición de brotes epidémicos, elevación en la morbimortalidad y en los costos.2

Existen dos bacterias de importancia que son causantes de infecciones nosocomiales, una de ellas es Staphylococcus aureus y la otra Pseudomonas aeruginosa, estas tienen un alto índice de resistencia a los antibióticos lo cual las ubica como un factor de riesgo en dichos nosocomios.

El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. Son bacterias no móviles, no esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría de los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa negativos. Entre las especies que colonizan al humano, las de mayor importancia clínica son: S. aureus y Staphylococcus lugdunensis; en tanto que en animales se encuentra además de S. aureus a Staphylococcus intermedius. 3La especie S. aureus se encuentra ampliamente distribuido entre los primates, pero no está restringido únicamente a ellos; por ejemplo, les produce mastitis en el ganado bovino y ovino. En el hombre, la localización nasal del S. aureus permite su diseminación y, como consecuencia, la multirresistencia a los antibióticos como a la meticilina (MRSA). 4, 5, 6,7

La resistencia bacteriana es un proceso continuo, que inició con la resistencia a penicilina por S. aureus. La introducción de las penicilinas resistentes a penicilinasas en la década de los 60 condujo al desarrollo de resistencia a meticilina y a la aparición de cepas de S. aureus resistente a la meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés). 4,8

En los últimos años se ha observado un considerable aumento de la resistencia a múltiples antibióticos, siendo el S. aureus resistente a la meticilina favorecido principalmente por el uso indiscriminado de antibióticos. Provoca así la diseminación de cepas de S. aureus en los hospitales de todo el mundo, lo que con lleva a uno de los mayores retos terapéuticos en la actualidad para la medicina. En pacientes diabéticos los MRSA están involucrados en un 20%. Debido a esto, su importancia ha ido en aumento, así como la aparición de multirresistencia, sobre todo a la meticilina. 5-8, 9,10

Durante varias décadas, el análisis molecular y genético de S. aureus ha revelado la presencia de adhesinas de superficie que median la adherencia y colonización de las células blanco, la secreción de enzimas y toxinas, responsables de la invasión, así como ser la causa de enfermedades distantes del foco inicial. El desarrollo de la genómica y la disponibilidad que se tiene de la secuencia completa de nucleótidos del genoma de S. aureus, ha ayudado a entender mejor su patogénesis. Aproximadamente 50% del genoma de S. aureus presenta homología con Bacillus subtilis sugiriendo que estos dos microorganismos comparten un ancestro común. S. aureus contiene un DNA exógeno, móvil, constituido por secuencias de inserción, transposones, bacteriófagos e islas de patogenicidad, que contienen determinantes específicos responsables del desarrollo de la enfermedad y resistencia a múltiples