GENETICA MOLECULAR.

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Los virus bacteriófagos: Son vectores de clonación, ya que durante la transducción algunos genes de la bacteria huésped pueden incorporarse a su genoma. Cuando el fago infecte otra bacteria, puede transferirle los genes de la primaza. Un fago usado frecuentemente es el bacteriófago lambda.

Los cósmidos: son vectores que contienen ADN foráneo, el denominado sitio cos procedente del genoma de un fago, que requieren para el empaquetamiento del ADN dentro de los viriones. Una de las ventajas es que pueden ser utilizados para clonar fragmentos grandes de ADN. Un ejemplo es el cósmido pJBS que este contiene un origen de replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos, un gen de resistencia a ampicilina (ampR) y una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación (BamHI,EcoRI, ClaI y Hindlll).

Métodos de transformación bacteriana

La transformación bacteriana es un proceso de vital importancia y gracias a esto es posible la introducción de plásmidos ya sea artificiales o naturales dentro de las bacterias. El proceso de transformación incluye la introducción de ADN exógeno en las células bacterianas y este ADN pasa a ser parte del material genético de la bacterial y a su vez este material genético puede ser heredado a las nuevas células todas las veces en que la bacteria se multiplique.

La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de material genético entre una célula bacteriana donadora y una receptora mediante el contacto directo o una conexión que las una. Fue descubierta por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946, la conjugación es un mecanismo de transferencia horizontal de genes como la transformación y la transducción, con la diferencia de que estos últimos no involucran contacto intercelular. Es decir que la transformación es un proceso por el cual las células captan ADN libre que está presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente dependiendo de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. La trasformación por choque térmico es la combinación de la temperatura y los cationes, la cual aumenta la porosidad de la membrana celular, facilitando la asimilación de los plásmidos. De esta forma atravesarán la membrana celular cualquier plásmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Generalmente los plásmidos “lineales” tienen más dificultad para penetrar la membrana. Esto quiere decir que los cambios bruscos de temperatura alteran la permeabilidad de la pared celular, lo que hace que estas células permitan la entada de ADN exógeno a través de la membrana celular. Durante el choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre éstos se encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular.

La transformación por electroporación es una técnica en la que un campo eléctrico se le aplica a las células con el fin de aumentar la permeabilidad de la membrana de la célula, permitiendo que el DNA pueda introducirse en la célula. Es decir que es la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto en donde se despolarizan sus membranas, lo cual permitirá que se formen pequeños orificios por los que penetran las moléculas que se encuentran alrededor.

El proceso de electroporación se utiliza a menudo para transformación de células mediante la introducción de nueva codificación de ADN. Si las bacterias y plásmidos son mezclados, las plásmidos pueden ser transferidas a las bacterias después de la electroporación. La electroporación se lleva a cabo con electroporators, que son especialmente diseñadas para dispositivos que crean un campo electrostático en una solución de la célula. La célula suspensión es pipeteada en un vaso o cubeta de plástico que tiene dos electrodos de aluminio en sus lados. Para la electroporación de bacterias, normalmente se utiliza una suspensión de alrededor de 50 microlitros. Antes de la electroporación, esta suspensión de bacterias se mezcla con el plásmido para ser transformado. La mezcla se pipetea en la cubeta, el voltaje y la capacitancia se fijan y se inserta la cubeta en el electroporator. Inmediatamente después de la electroporación, se agrega un mililitro de medio líquido a las, y el tubo se incuba a temperatura óptima de las bacterias por una hora o más para permitir la recuperación de las células y la expresión del plásmido, seguido de cultivo bacteriano.

Células competentes

La obtención de células competentes en consiste en ir concentrando un cultivo recogido en fase logarítmica, mediante lavados sucesivos en una solución fría aproximadamente a 4ºC de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de células y ADN se someten unos 2 minutos a 42ºC por choque por calor. Este tratamiento altera las envolturas sobre todo la membrana externa y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plásmidos entran a la célula como moléculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplásmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algún o algunos antibióticos conferidos por los plásmidos artificiales. El shock térmico, la inclusión de iones monovalentes, el crecimiento en medios con elevada concentración de Mg+2, son tratamientos que permiten elevar la frecuencia de transformación considerablemente.

En la preparación de células electrocompetentes se basa en la obtención de células libres de iones. Para ello un cultivo en fase logarítmica (OD entre 0.5 y 0.7) se lava sucesivas veces con H2O o con una solución de glicerol al 10%, aproximadamente 4 a 5 veces. Posteriormente la mezcla ADN o las células y se somete a cortos pulsos de corriente eléctrica de alto voltaje, lo cual altera las envolturas y permite la captación de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas. Este método es más eficiente para la