La bacteria gram negativa E

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Para la desnaturalización del DNA molde se utilizaron temperaturas en 90 y 95°C la cual produce la ruptura de los puentes de hidrogeno intercaternarios dando así la separación de la doble hélice de DNA. Y para que ese proceso se mantenga la temperatura debe ser constante por lo menos por 5 min.

Basándonos en los resultados obtenidos de la electroforesis se puede observar en la (figura 1) que los presentaron una mejor corrida fueron los posos 1, 2, 5, 6, 7, 8 y 12 los cuales se encuentran en un rango aproximado de 900 a 3000bp. De esto se puede deducir que hubo una buena extracción del material genético obteniendo así resultados positivos para estas muestras. Y los posos 3, 4, 9, 9 y 10 están en un rango de 1000 a 3000bp lo cual tan bien es positivo y el poso 11 no se corrió la muestra así que se puede deducir que tal vez no tomaron las cantidades adecuadas de los reactivos mostrando una muestra con un resultado negativo.

Se trabajó con el Orange G el cual es un colorante de seguimiento utilizado en la electroforesis de ácidos nucleicos para realizar un seguimiento delante de DNA en geles de agarosa. También se utiliza en la electroforesis el SDS- capilar como un estándar. Por lo general se ejecuta en 50 puntos básicos hasta en un 2,5 % de agarosa. Y el syber Safe es un colorante muy sensible con una elevada afinidad por el DNA, que puede detectar cantidades de tan sólo 50 pg de DNA. Se utiliza en una dilución 1/10.000 en agua para el teñido del gel tras la electroforesis su función como agente intercalante en donde una molécula plana e hidrófoba que se inserta entre los pares de bases contiguos de la doble hélice, y así interrumpe la alineación y el emparejamiento de bases de las cadenas complementarias por el cual se da un desenrollamiento parcial y una reducción de la torsión; al intercalarse en el DNA este distorsiona la doble hélice y nos permite su visualización.5

Al momento de realizar la preparación del Gel de agarosa hay que tener mucho cuidado ya que este no debe contaminarse, se tienen que realizar los pasos con mucho cuidado para obtener un buen molde como por ejemplo al gel en estado líquido se le agrega el syber safe sustancia química que funciona como agente intercalante si esto no se realiza no se lograra observar nada al momento de realizar la electroforesis, si se le agregara al solidificarse no funcionaria. Y otro aspecto importante es que al retirar el gel del molde en el que se solidifico ahí que hacerlo con mucho cuidado ya que este puede agrietarse y al momento de realizar la electroforesis esta no pase por las grietas y no se observe nada.

CONCLUSIONES

Fueron explicados correcta y explícitamente los fundamentos que participan en la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR. Se amplió y visualizó mediante PCR y Electroforesis respectivamente, fragmentos de DNA extraídos de E. coli obteniendo DNA genómico con un patrón de bandas dadas según el marcador de peso molecular de 2000, 1500 y 1200 pares de bases.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las diferentes tipos o variantes de la técnica de PCR y describa la diferencia o modificación a la técnica inicial?

- RT-PCR: Detección de mRNA.

- PCR-RFLP: Polimorfismo genético.

- RAPDs: Amplificación con random primers-polimorfismo.

- PCR Nested: Amplificación de una secuencia dentro de otra previamente amplificada.

- PCR Multiplex: Varios targets diferentes en forma simultaneas.

- Inverted PCR: Para conocer secuencias flanqueadoras.

- Long PCR: Amplificación de fragmentos grandes 10-20 Kb. CR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR).

PCR anidada: Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.6

PCR de extensión solapada (Mutagénesis): Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de DNA. Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos en otra reacción para producir el DNA mutado de longitud completa.6

PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de DNA blanco y luego detección mediante hibridaciónin situ convencional con sondas de DNA/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.6

PCR múltiple: PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de DNA. Ventajas: información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso.6

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de DNA, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un DNA complementario al ARN (DNAc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

- Retrotranscripción a partir del ARN.

- Amplificación a partir de la primera hebra