Los aminoglucósidos diseñadores previenen la pérdida de células ciliadas cocleares y la pérdida de audición

...

Las células ciliadas del oído interno son mecanorreceptores equipados únicamente con canales mecanotransductores (MET) situados en sus paquetes estereoculares (19). Debido a que el transporte de aminoglucósidos

---------------------------------------------------------------

[pic 2]

Figura 1. Los nuevos aminoglucósidos han disminuido la ototoxicidad in vitro. (A) Esquema que muestra que los canales MET no selectivos de células capilares son permeables a cationes (calcio y aminoglucósidos). (B) El compuesto de sisomicina está compuesto de 3 anillos. Se hicieron modificaciones dirigidas a los grupos amina en el segundo anillo (N1) y tercero (N3 "). Se utilizaron tres grupos químicos distintos para modificar la sisomicina: MS, PS y BZ. N1BZ: R ^ {1} = BZ, R ^ {2} = H; N _ {1MS}: R _ {1} = EM, R _ {2} = H; N1PS: R _ {1} = PS, R _ {2} = H; N1,3 "BZ: R1 = BZ, R2 = BZ; N1,3 "MS: R ^ {1} = EM, R ^ {2} = EM; N1,3 "PS: R1 = PS, R2 = PS; N _ {3} "BZ: R _ {1} = H, R _ {2} = BZ; N _ {3} "MS: R _ {1} = H, R _ {2} = EM; N _ {3} \ rightarrow PS: R _ {1} = H, R _ {2} = PS. (C) Paradigma experimental utilizando cócleas de ratas P4 para evaluar la ototoxicidad de la sisomicina y sus derivados in vitro. AG, aminoglucósido. (D) Micrografía representativa del giro basal de cócleas cultivadas no dañadas, que muestran células ciliadas externas e internas que expresan miosina VIIa (OHC e IHC). (E) Cicloas tratadas con sisomicina (200 μM) que muestran una pérdida dramática de células ciliadas externas. (F) Las células ciliadas se conservaron en cocleas cultivadas con N1MS (200 μM). (G) Supervivencia de células capilares (normalizada a cócleas cultivadas no dañadas) en cócleas (divididas en 3 regiones [base, media y ápice]) tratadas con sisomicina o sus derivados (todos 200 μM). Sisomicin causó un gradiente basal-apical de la pérdida de células capilares, mientras que el tratamiento con cada uno de los 9 derivados de sisomicina causó menos pérdida de células del cabello. (H) Análisis de dosis-respuesta que comparan la dosis de sisomicina y el tratamiento con N1MS con la pérdida de células ciliadas en el giro basal de la cóclea. Sigmoidal mejor ts estimado KDs de sisomicin y N1MS a 100 μ M y 1,7 mM, respectivamente. Los datos se muestran como media ± SEM. N = 4-10 para G y H. Barra de escala: 25 μm.

(9, 20-23), hemos rediseñado y modificado el aminoglucósido sisomicina en base a las propiedades biofísicas de los canales MET de células capilares (24) y las interacciones ribosomas bacterianos aminoglucósidos (25 ). Aquí, hemos caracterizado 9 derivados de sisomicina con ototoxicidad disminuida in vitro, con 3 de los 9 compuestos que exhiben anti-E comparable. Coli al compuesto de origen sisomicina. El compuesto de plomo, N1MS, mostró permeación reducida del canal MET, probablemente debido a la carga reducida por molécula de N1MS. En un modelo murino de sordera inducida por aminoglucósidos, N1MS fue significativamente menos ototóxico que sisomicina. Finalmente, el tratamiento con N1MS eliminó la infección del tracto urinario in vivo. Colectivamente, nuestro estudio caracteriza un novedoso aminoglucósido no tóxico y también introduce un enfoque para modificar los aminoglucósidos existentes que pueden reducir la ototoxicidad manteniendo la actividad antimicrobiana.

---------------------------------------------------------------

Resultados

Los nuevos derivados de aminoglucósidos exhiben una ototoxicidad disminuida in vitro. Los gradientes electroquímicos conducen los cationes a través de los canales MET del cabello (Figura 1A y referencia 24). Aunque la naturaleza molecular de este canal sigue siendo controvertida, existe un cuerpo significativo de literatura sobre las propiedades biofísicas (24, 26-30). Dado que los aminoglucósidos son bloqueadores permeables del canal MET, la hipótesis de que la modificación dirigida para reducir los sitios cargados positivamente en la molécula de aminoglucósido dificultaría la entrada de fármacos en las células capilares y, por tanto, prevenir la ototoxicidad (9). Utilizando métodos sintéticos establecidos (31), primero protegíamos químicamente 3 de los grupos amina sobre el aminoglucósido sisomicina, un precursor biosintético de gentamicina, permitiendo así la modificación subsiguiente del sitio amina N1 y / o N3 '(Figura 1, A y B, material suplementario disponible en línea con este artículo; doi: 10.1172 / JCI77424DS1). La sisomicina fue seleccionada porque

---------------------------------------------------------------

[pic 3]

Comercialmente disponible a alta pureza (> 98%) en comparación con gentamicina. Para modificar estos 2 grupos amina (1 y 3 '') (figura 1B y figura complementaria 1B), se seleccionaron 3 restos (metilsulfonil [MS], fenilsulfonilo [PS] y benzoil [BZ]), que se predijeron mediante X Como los sitios dispensables para los efectos antimicrobianos dependientes de la unión de ribosomas bacterianos de los aminoglucósidos (25). Estos grupos funcionales se conjugaron con el grupo 1 amina (N1MS, N1PS, N1BZ), grupo amina 3 '' (N3''MS, N3''PS, N3''BZ) o ambos grupos 1 y 3 '' amina (N1,3''MS, N1,3''PS, N1,3''BZ) de sisomicina (Figura 1B, Figura 1C suplementaria, y Figura 2 suplementaria). Los esquemas de síntesis química se detallan en la Figura 1 complementaria y ref. 32).

Al igual que la gentamicina, la sisomicina (200 μM durante 1 hora) causó un gradiente basal-apical de pérdida de células capilares en cultivos cocleares de ratas (Figura 1, C-H y Tabla Suplementaria 1). En el equivalente molar del compuesto original sisomicina (200 μM), los nueve nuevos derivados de sisomicina indujeron significativamente menos pérdida de células capilares, con 4 compuestos que mostraron casi ninguna toxicidad de células capilares (Figura 1G y Tabla Suplementaria 1). La conjugación con el resto MS fue más efectiva que con las estructuras PS o BZ en la mejora de la oto toxicidad (Figura 3, A-C), y las 3 modificaciones del esqueleto de sisomicina con el resto MS eliminaron la ototoxicidad Figura 3, D - F). Los experimentos de dosis-respuesta (exposición al fármaco durante 1 hora, como anteriormente) mostraron que N1MS (> 95% de pureza, Figura 2 suplementaria) es 17 veces menos tóxico que la sisomicina (pureza al 98%, KD = 100 ± 2 μM y 1,7 ± 0,2 mM , Respectivamente, Figura 1H y Tabla Suplementaria 2). Estos datos sugieren que la modificación específica de los aminoglucósidos