Modelo murino Thy-1 Crh-2 YFP y técnica CLARITY.

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estructuras transparentes, ya que los lípidos son los que les dan color. A partir de esto, el órgano puede ser inducido a técnicas de tinción para localizar estructuras específicas, células, conectividades, etc. Debido a la pérdida de las membranas celulares es posible visualizar cada célula, su estructura y sus componentes.

Para llegar a estos resultados se tiene que seguir una serie de pasos. Primeramente, hay que exponer el órgano a una temperatura de 4°C (hasta que se enfríe) y sumergirlo en formaldehido sobre una infusión de monómeros de hidrogel. El hidrogel y las biomoléculas se hibridan después de haber incrementado la temperatura a 37°C en un lapso de 3 horas. El formaldehido facilitará la unión de las proteínas y ácidos nucleicos a la estructura de hidrogel híbrido. Durante este proceso las únicas biomoléculas que no se adjuntan son los lípidos por lo que podremos extraerlos para así obtener un órgano ópticamente transparente. Para esto aplicamos un campo eléctrico (electroforesis) al tejido, el cual va a estar sumergido a una solución de detergente iónico (dodecilsulfato sódico [SDS]), estos campos acelerarán el transporte del detergente para que llegue más rápido a los lípidos, los cuales serán disueltos para luego ser extraídos, esto dura entre 5 a 8 días. Terminando este proceso obtenemos un órgano completamente clarificado, en donde todas sus estructuras se mantienen en su lugar.

A pesar de ser una técnica nueva, existen otras ya parecidas que usan las mismas técnicas, pero para otros fines, como lo es la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida, que es usada para la separación de biomoléculas a través de un campo eléctrico dependiendo de su carga, peso y estructura. Esta técnica también hace uso del detergente dodecilsulfato de sodio, pero para analizar el peso molecular de proteínas, además de identificarlas y monitorearlas. A diferencia del Clarity, en esta técnica se tiene que hacer el gel, en donde se le va a implementar el campo eléctrico para separar las biomoléculas que le fueron añadidas.

La técnica Clarity usa la Yellow Fluorescent Protein (YFP) a diferencia de las técnicas inmunofluorescentes (IF) regulares que hacen uso de la Green Fluorescent Protein (GFP). Las ventajas de usar clarity es que sólo tiene un 8% de pérdida de proteínas celulares, pero mantiene las estructuras. También que al no tener bicapa lipídica hace a la membrana permeable, por lo que permite el paso de sondas moleculares y así los anticuerpos localicen a sus antígenos con mayor facilidad, a diferencia de las IF que hay que poner en un portaobjetos el antígeno donde se le tiene que unir un anticuerpo específico, luego se le añade un suero anti-inmunoglobulina humana la cual está unida con una molécula fluorescente y finalmente hay que esperar a que esta molécula se una al anticuerpo específico . Además, no es necesario que el órgano este recién sacado del cuerpo, también se puede aplicar Clarity a órganos que han sido guardados desde hace mucho tiempo (pero mantenidos en buen estado) y es aplicable a muchos tipos de tejidos y órganos de cualquier tamaño. Pero como cualquier cosa, Clarity tiene sus desventajas a comparación de las IF; como el que esta técnica es un proceso con varios pasos y que se lleva a cabo durante varios días, las IF son al momento los resultados; también el aplicarle técnicas de inmunotinción a órganos o tejidos más gruesos requiere de mucho tiempo y el costo de los materiales es alto.

BIBLIOGRAFÍA

Clarity for mapping the nervous system, Kwanghun Chung y Karl Deisseroth. Junio 2013, Nature Methods 10, 508-513.

Structural and molecular interrogation of intact biological systems, Kwanghun Chung, Janelle Wallace, Sung-Yon Kim, Sandhiya Kalyanasundaram, Aaron S. Andalman, Thomas J. Davidson, Julie J. Mirzabejov, Kelly A. Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra K. Denisin, Sally Pak, Hannah Bernstein, Charu Ramakrishnan, Loagan Grosenick, Viviana Gradinaru y Karla Deisseroth. Marzo 2013, Nature.

http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20-%20Cap13%20PAGE.pdf

http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Laboratorio_TPN8.pdf