PRÁCTICA 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO Y ESTERILIZACIÓN

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Esterilización de medios y equipos.

La esterilización es el proceso de obtener un medio libre de toda forma de vida. Son tres las formas básicas en las cuales se puede alcanzar la esterilización de los medios y suministros. La técnica más útil es el autoclavado, en el cual los artículos son esterilizados por exposición a vapor a 1210C y 15 lbs de presión por 15 minutos o más, dependiendo de la naturaleza del artículo. Bajos estas condiciones los microorganismos, e incluso las endosporas, no sobreviven más allá de 13 ó 14 minutos. Este método es rápido y confiable. Los autoclaves modernos están diseñados para que todo el aire sea expelido y sólo el vapor esté presente en la cámara del autoclave y además tienen controles cuidadosos de la temperatura. Casi todos los medios y cualquier otra cosa que resista 1210C y al vapor, pueden ser esterilizados de esta manera.

A menudo debe esterilizarse material de vidrio, como pipetas y cajas petri. El vapor tiende a manchar el vidrio y también a dejar humedad. Por ello, este tipo de artículos son por lo general esterilizados con calor seco. El material es colocado en un horno eléctrico diseñado para operar entre 1600 y 1700C. Puesto que el calor seco no es tan efectivo como el calor húmedo, el material de vidrio debe mantenerse a esta temperatura por 2 horas o más. La temperatura del horno no debe rebasar los 1800C ya que cualquier rastro de papel o algodón se chamuscará.

Algunas veces el medio de cultivo se prepara con algunos componentes que no resisten el calentamiento a 1210C. Tales medios pueden ser esterilizados pasándolos a través de un filtro bacteriológico el cual remueve físicamente bacterias y microorganismos mayores de la solución y por lo tanto la esteriliza sin calor. Los filtros ultrafinos de fibra de vidrio con discos de 0.9 a1.4 μ de tamaño de poro y los filtros de embudo de asbesto (de 3 mm de espesor y poro de 0.1 μ), son opciones efectivas para esterilizar soluciones. Sin embargo, si se usan filtros con tamaño de poro mayor a 0.22 μ hay una extremadamente alta probabilidad de que el filtrado no sea estéril. Debido a ello, la técnica más útil y popular es el uso de membranas de celulosa o policarbonato estériles y especialmente preparadas de tamaño de poro apropiado. Generalmente para esterilizar se emplean membranas con poro de 0.22 μ. Actualmente hay comercialmente disponibles un gran

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número de aparatos para esterilización con membranas tanto para volúmenes pequeños como grandes.

Otras dos técnicas de esterilización emplean radiación ultravioleta y óxido de etileno. La radiación ultravioleta (UV) de alrededor de 260 nm es muy letal para muchos microorganismos pero no penetra vidrio, películas de polvo, agua y otras sustancias, de manera efectiva. Debido a esta desventaja la radiación UV es utilizada como agente esterilizante sólo en unas pocas situaciones particulares. Por ejemplo, algunas veces se colocan lámparas UV en el techo de cuartos o gabinetes de seguridad biológica para esterilizar el aire y algunas superficies expuestas.

Muchos artículos sensibles al calor, tales como cajas petri desechables de plástico, jeringas, suturas y catéteres, se esterilizan con el gas óxido de etileno. El óxido de etileno es tanto microbicida como esporocida y mata al unirse covalentemente a las proteínas celulares. Es un agente esterilizante particularmente efectivo porque penetra rápidamente en materiales empacados, incluso envolturas plásticas.

Objetivos.

- Describir los diferentes tipos de medios de cultivo y su composición.

- Describir las diferentes maneras de tapar tubos de cultivo.

- Describir como preparar y transferir medios de cultivo.

- Preparar medios definidos y no definidos, así como agar en placa.

- Describir el concepto de esterilidad.

- Describir como pueden esterilizarse diferentes medios, suplementos y equipos.

- Usar el autoclave de manera correcta y segura.

Material necesario.

- Autoclave (2 por grupo) con 4 mecheros fisher.

- Cajas petri (5 por equipo).

- Tubos de cultivo 18x150 mm con tapón de rosca (20 por equipo).

- Gradilla o recipiente para colocar los tubos (pueden ser vasos de precipitado o latas).

- Medio definido según la tabla 1.

- Medio complejo según la tabla 2.

- 1 matraz erlenmeyer de 100 mL (por equipo)

- 1 matraz erlenmeyer de 500 mL (por equipo).

- 4 equipo de baño maría (por grupo).

- 2 pipetas de 10 mL (por equipo)

- agar bacteriológico (2.8 g por equipo)

- Papel aluminio.

- Mechero bunsen (3 por grupo).

- Soporte con anillo y tela de asbesto (3 por grupo).

- Papel estrasa.

- Termómetro 0 a 1000C. (4 por grupo).

- Guantes de asbesto (por equipo).

Procedimiento.

Preparación de un medio químicamente definido (por equipo).

- Prepare 40 mL de un caldo de glucosa-sales minerales como se indica en la tabla 1. A un matraz Erlenmeyer de 100 mL agregue 30 mL de agua destilada. Pese y agregue cada ingrediente al agua en el orden listado agitando después de agregar cada uno de ellos hasta que se disuelva por completo. Añada los 10 mL restantes de agua destilada para lavar las paredes del matraz.

- Ajuste el pH de 7.2 a 7.4 añadiendo sólo lo suficiente de HCl o NaOH.

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- Distribuya 5 mL del caldo en cada uno de 5 tubos usando una pipeta de 10 mL y luego tape los tubos sin apretar. Coloque los tubos en una gradilla o en un vaso y luego en el autoclave.

Preparación de un medio complejo.

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