Regulación de la replicación del ADN después de un choque térmico por interacciones con la replicación de proteína A-nucleolina

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En un esfuerzo para caracterizar componentes reguladores putativos de la replicación del ADN en las células expuestas al calor, introdujimos el virus de simio 40 (SV40) 1-basado en el ensayo de la replicación del ADN in vitro. En este ensayo, la replicación de los plásmidos que portan el origen de SV40 de replicación del ADN (Ori) se lleva a cabo in vitro utilizando cualquiera de los extractos crudos citoplasmáticos de células humanas, o proteínas purificadas a partir de tales extractos (22-26). Sólo se requiere una proteína de origen viral, el antígeno tumor grande SV40. El ensayo proporciona un sistema bien controlado y definido molecularmente para estudiar aspectos de regulación de la replicación del ADN, y permite la separación de los efectos de regulación dirigidas a factores de replicación de ADN de los efectos del calor sobre el sustrato de ADN.

Utilizando este ensayo se informó (27) que se prepararon extractos citoplasmáticos a partir de células calentadas tenía una actividad de replicación de ADN reducida, en comparación con extractos preparados a partir de células no calentadas, y que esta reducción en la actividad de replicación de ADN fue causado específicamente por una inactivación de la proteína de replicación A (RPA) (28-30). La adición de RPA recombinante (rRPA) en estas reacciones invertido completamente la inhibición. Debido a que los niveles del EPR fueron similares en los extractos de células calentadas y no calentadas y porque RPA fue relativamente resistentes a la inactivación de calor directo, propusimos que la respuesta observada refleja la activación de un punto de control que dirige e inactivados RPA. Un papel regulador para RPA en la replicación del ADN también se ha sugerido en las células expuestas a la radiación ionizante (31-35).

RPA es un componente esencial del metabolismo del ADN eucariota y tiene una actividad como la principal proteína de cadena sencilla DNAenlazante (para revisiones, véanse las referencias. 36 y 37). Es un heterotrímero compuesto en humanos de 14-kDa (hRPA3) subunidades de 70 kDa (hRPA1), 29-kDa (hRPA2). Estudios genéticos y bioquímicos sugieren un papel para RPA en las etapas de iniciación y elongación de la replicación del ADN (36, 37). RPA también se requiere para la reparación por escisión de nucleótidos y la recombinación de ADN homóloga (38-41). RPA2 es fosforilada de una manera dependiente del ciclo celular y en respuesta al daño del ADN, pero el significado de regulación de estas fosforilaciones no se ha establecido (36, 37). RPA también interactúa con una variedad de proteínas implicadas en el metabolismo del ADN incluyendo Rad51 (42), Rad52 (43, 44), XPA (45-47), y p53 (48-50). Por último, el EPR es fosforilada por la ADN-dependiente de la proteína quinasa y por ataxia telangiectasia mutada (51-55). Varias de estas interacciones y modificaciones son compatibles con una función reguladora para RPA en la replicación del ADN, y con un papel en las respuestas celulares a daño en el ADN, aunque la evidencia directa todavía falta.Debido a que la fosforilación significativa de RPA2 no se observó después de la exposición al calor, se especuló que si el EPR es un objetivo de los procesos que regulan la replicación del ADN, que debe ser modificado por mecanismos distintos de la fosforilación (27). Recientemente, se han presentado pruebas de que la interacción con la nucleolina, una proteína nuclear importante implicado en la biogénesis de ribosomas y diversos otros procesos biológicos (para revisiones, véanse las referencias. 56 y 57), puede regular las funciones de replicación de RPA (58).Este sentido, ampliar nuestros estudios sobre la regulación de la replicación del ADN en las células expuestas a choque térmico y preguntamos si los efectos de informes anteriores del calor sobre la replicación del ADN in vitro y la inactivación asociado de RPA (27) se derivan de una interacción con la nucleolina. Los resultados demuestran las interacciones RPAnucleolina perfectamente que correlacionan con actividad in vitro la replicación del ADN y sugieren que esta interacción refleja una etapa temprana de la respuesta celular al estrés por calor.