SÍNTESIS DE AG Y REGULACIÓN

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2) Mecanismo a largo plazo.

Además de los mecanismos rápidos hay mecanismos más lentos que es activar la transcripción de genes que codifican para enzimas que favorecen la síntesis de AG o el proceso de glucólisis. Cuando hablamos de regulación transcripcional hablamos de realizar un cambio en el número de moléculas de enzimas, que haya un factor de transcripción que favorezca por ej la transcripción de genes que codifican enzimas. En general los factores de transcripción van a modificarse según señales hormonales (por ej aumento o disminución de insulina, glucagon) o señales dietarias (por ej aumento o disminución de glc). Los factores de transcripción en gral se activan por unión a una proteína específica que puede ser co-activadora y que ayuda a la acción del factor de transcripción. A su vez hay procesos de modificación covalente de los factores de transcripción que también pueden activarlo. Por ej la insulina puede reg la transcripción de más de 150 genes.

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SREBP y ChREBP actúan sinérgicamente, simultáneamente y en forma aditiva para reg la expresión de genes. En la región promotora del gen pueden actuar tanto SREBP como ChREBP, o sea que tienen regiones consenso del DNA que reconocen SREBP (SRE) y ChREBP (ChoRE). ChoRE es una secuencia consenso constituida por dos cajas E separadas por 5 nucleótidos. ChREBP se une a una región ChoRE, pero requiere de asociación de una proteína co-activadora, Mlx. La diferencia es que SREBP es regulado por insulina y ChREBP es regulado por nutrientes.[pic 9]

En la estructura primaria de ChREBP muestra que en la región N-ter hay secuencias NES (señal de exportación nuclear) en la zona C-ter hay una secuencia rica en prolina que permite interacciones proteína-proteína; y bHLH/ZIP (aa básico, motivo estructural hélice-loop-hélice, cierre de leucina) motivo estructural de unión al DNA. Además tiene residuos de Serina y Treonina en la zona N-ter o en la zona C-ter que se pueden fosforilar.

Hasta ahora sabemos que ChREBP: se une al DNA (la carga + del aa básico interactúa con las q- del DNA), transloca al núcleo (por la señales de importación y exportación), se fosforila y se asocia a proteínas.

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¿Cómo actúa ChREBP? Si la cc de glc es baja, ChREBP se encuentra fosforilado en el citosol (forma inactiva). Pero si la cc de glc es alta entra en el hepatocito, se genera la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato por lo cual aumenta el intermediario xilulosa-5P (Xu5P) que a su vez activa a una fosfatasa (PP2A) que desfosforila parcialmente a ChREBP y que ahora transloca al núcleo. En el núcleo otra vez una fosfatasa PP2A lo desfosforila, que ahora se une a Mlx que es su co-activador y este complejo se une a la región ChoRE (secuencia consenso) y así estimulan la transcripción de enzimas que intervienen en la síntesis de AG o en la glucólisis.

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Los autores que trabajan con este tema piensan que ChREBP se desfosforila en el citosol y que tiene que haber una act fosfatasa en el citosol que sea responsable de esta desfosforilación. Trabajan con una fracción citosólica de hígado de ratas alimentadas con HdC (A, columna 2) y ayunadas (A columna 1) y la incuban con un péptido de ChREBP que se encuentra fosforilado con P32. Miden la liberación de fósforo radiactivo, es una manera de medir la act de la fosfatasa. La act fosfatasa es mayor en las ratas alimentadas. Piensan ahora que la fosfatasa puede ser activada por un metabolito endógeno que puede provenir de la glucólisis o de la vía de las pentosas. Lo que hacen es pasar las fracciones citosólicas por un sephadex G50 para sacar los metabolitos endógenos, y exógenamente le agregan el metabolito de estudio. Agregan todos metabolitos que pueden estar en el citosol por separado: Xu5P, F6P, PEP R5P, G6P, 3PG, Ru5P, 6PG, etc. Comprueban que la Xu5P es la única que activo a la fosfatasa.[pic 12]

¿Cuál es el rol que pueden tener las regiones C y N-ter de ChREBP en la localización subcelular? Tenemos el ChREBP WT, ese ChREBP lo van a fusionar a una GFP (proteína fluorescente verde). Después hacen otra construcción que es la región N-ter de ChREBP unida a GFP y después la región C-ter de ChREBP unida a GFP. Incuban hepatocitos con el ChREBP WT, ChREBP N-ter y ChREBP C-ter en presencia de alta y baja glc; y estudian por microscopía de fluorescencia la localización de las proteínas presentes. Si vemos el WT, a baja cc de glc se encuentre en el citosol; si hay alta cc de glc ChREBP transloca al núcleo. Cuando se hace con la N-ter, se ve lo mismo que con WT. En la C-ter no hay un patrón definido, está por todos lados, no tiene la señal. Concluyen que la región N-ter es la que responde a cambios en la cc de glc y es responsable de la localización nuclear ChREBP en condiciones de alta glc.

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Esta es una proteína que tiene una secuencia de localización nuclear unida a una importina. A veces ocurre esto (izquierda) y otras que la proteína cargo con una señal de localización nuclear es reconocida por una importina alfa y luego por la importina o Rc final beta (derecha), como que necesita una proteína adaptadora intermedia.

PULL DOWN (experimento)

Lo hacen para ver si intervienen estas importinas en el reconocimiento de ChREBP, porque si ChREBP tiene que translocar al núcleo, tendría que ser reconocido por importinas y hacer todo el proceso (diapo izquierda).

Se utilizan unas perlas como si fueran de agarosa o sepharosa que tienen un Ac que reconoce ChREBP (matriz a la cual se puede unir ChREBP) que están en suspensión, y va a actuar como una caña de pescar intentando atrapar a la proteína. Por ej lo pongo en contacto con la importina, si ChREBP reconoce a la importina la está pescando, una vez que lo pescó, incubo un tiempo para favorecer la interacción y centrifugo. Se separa en el pellet la suspensión que tiene la importina. Después agrego buffer muestra para SDS-PAGE que va a disociar lar proteínas que están unidas. Si yo capté la importina, con el buffer muestra la vuelvo a disociar y ese SN con la importina disociada lo siembro en un gel y lo revelo por WB. Dice importina GST (glutatión-S-transferasa) porque se marca con eso para después revelar.

Si el ChREBP lo incubo con importina alfa y beta y después hago el WB veo que las dos aparecen en las WB. Si incubo sólo con importina alfa ChREBP la reconoce a la importina alfa. Pero si sólo incubo con la beta, se reconoce muy mal, es mucho más débil.