TRABAJO PRÁCTICO N°2 PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO DE Escherichia Coli

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Lisis alcalina

Se agregó al tubo eppendorf 0.3 ml de la Solución 2, aumentando así el pH de forma abrupta por el NaOH (aproximadamente de pH8 a pH12), por lo que se produjo la ruptura de la pared celular de peptidoglicano, la solubilización de las membranas externa e interna, la degradación parcial del RNA y la desnaturalización del DNA genómico y plasmídico. El SDS al ser un detergente iónico fuerte, solubilizó los fosfolípidos de las membranas dejando el paso libre al DNA. Además, por esta misma razón, rompió los enlaces no covalentes que estabilizaban las estructuras, logrando la desnaturalización de proteínas.

Si bien ambos DNA, tanto el genómico como el plasmídico se desnaturalizan, sólo el genómico se fragmenta debido a su gran tamaño. En el DNA plasmídico, al ser de tamaño mucho más disminuido no se fragmenta, pudiendo así mantener el superenrrollamiento y el vínculo físico entre sus hebras.

Se puede decir que con el agregado de la Solución 2, efectivamente se terminó de llevar a cabo la lisis de las bacterias.

Renaturalización del DNA plasmídico y separación del DNA genómico

Luego, se agregaron 0.3 ml de Solución 3, una solución ácida que al encontrarse a pH 4.8, neutraliza el pH básico de la solución de lisis (Solución 2). Los iones K+ del Acetato de Potasio, estabilizan los fosfatos de las hebras de DNA favoreciendo su renaturalización. EL DNA plasmídico al haber mantenido las dos hebras asociadas, se renaturaliza correctamente y permanece en solución, mientras que el DNA cromosómico al estar roto y ser más largo se renaturaliza parcialmente. Los iones K+ reemplazan al Na+ en el SDS, disminuyendo así la solubilidad del detergente. Como consecuencia, se formó una malla que facilitó la precipitación del DNA genómico, restos de membranas y proteínas mal renaturalizadas, etc.

Luego de centrifugar, se obtuvo un pellet donde se encontraba el ADN cromosómico mal renaturalizado más restos de proteínas, membranas, y un sobrenadante con el DNA plasmídico que queríamos. Se transfirieron 0.7 ml del sobrenadante a otro eppendorf rotulado y se le agregaron 0.7 ml de isopropanol a temperatura ambiente. El isopropanol al ser un alcohol de tres carbonos, disminuyó la polaridad del medio de la solución acuosa de DNA y las interacciones DNA-solvente, provocando la precipitación del ADN plasmídico.

Se mezcló por inversión y se llevó a centrifugar durante 30 minutos a máxima velocidad.

*Observación: al trabajar con un volumen restringido, se utilizó isopropanol y no etanol ya que tiene una cadena carbonada más corta, por ende, más polaridad. Se necesitó menos cantidad de isopropanol que de etanol para conseguir el efecto deseado.

Luego de la centrifugación se obtuvo nuevamente un pellet donde se encontraba el ADN plasmídico, y un sobrenadante con isopropanol. Se descartó el sobrenadante y se agregaron 0.5 ml de etanol 70%. Se mezcló suavemente por inversión para que se despegue el pellet y se lave de sales que precipitaron con el ADN plasmídico. El etanol 70% tiene una polaridad intermedia que permite disolver muchas de las sales pero sin disolver el DNA.

Se llevó a centrifugar 5 minutos a máxima velocidad. Nuevamente se obtuvo un pellet con el ADN plasmídico y un sobrenadante con Etanol 70% y sales. Se descartó el sobrenadante con pipeta y se eliminaron las gotas que quedaban con la pipeta P200.

Se resuspendió el pellet en 0.02 ml de agua MilliQ conteniendo 0.01 ml de RNasa 10 mg/ml. Esto hace que, si quedaron restos de RNA en el plásmido, la RNasa lo degrade para así obtener un plásmido más “limpio”.

Se guardó el eppendorf con el pellet resuspendido, a -20°C.

RESULTADOS

Si bien no hubo resultados visibles, suponemos que el procedimiento fue realizado satisfactoriamente, debido a que hemos seguido con rigurosidad los pasos del protocolo.

CONCLUSIÓN

El plásmido trabajado, al ser de alto número de copias, permitió la extracción de gran cantidad de DNA plasmídico, a partir de menos cantidad de bacterias de las que hubiésemos necesitado en caso de no contar con un plásmido de alto número de copias.

Podemos decir también que, los fenómenos de desnaturalización y renaturalización abrupta, son la base de este método que permite la extracción de DNA plasmídico.

Se espera que los grupos que resuspendimos el pellet (sea decir el plásmido) con RNasa, obtengamos un plásmido más “limpio”, en cuanto a lo que refiere la pureza del DNA plasmídico. (¿?) Y estos resultados poder verlos aplicados en algún otro método.