Traduccion de articulo

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materiales y métodos

productos químicos

Anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra longitud completa eIF2α (FL-315) se obtuvo de Santa Cruz. Anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra fosforilada Ser51 eIF2α (9721) se obtuvo de señalización celular. Anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se obtuvieron de DAKO. dl -Methioninol, l leucinol y caliculina A fueron adquiridos de Sigma.

Manipulación y tratamiento de los huevos y embriones

Los erizos de mar ( Sphaerechinus granularis ) se recogieron en la zona de Brest (Francia) y se mantuvieron en agua de mar corriente. El desove de los gametos se indujo por inyección intracoelomic de 0,1 M de acetilcolina. Huevos, recogidos en agua de mar filtrada-Millipore de 0,22 micras, se dejellied por agitación durante 30 s en agua de mar filtrada (pH 5), se enjuagaron dos veces en agua de mar fresca y se suspendieron en agua de mar filtrada a 5% (v / v) de dilución. Esperma diluido se añadió a los huevos y se retira después de 5 min. Los experimentos solamente se realizaron en lotes que presentan mayor que 90% de la fertilización. Cada experimento utiliza gametos y huevos de una sola hembra. A la hora indicada después de la fertilización, se añadieron inhibidores al medio de incubación a la concentración indicada. Para obtener extractos de proteína total en diferentes momentos después de la fertilización, 0,2 ml de 5% de cultivo de embriones fue tomada, y las células sedimentadas se homogeneizaron en 0,1 ml de tampón SDS-fix (2% de dodecilsulfato de sodio, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol, y 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8).

análisis de Western blot

resolución electroforética de las proteínas se realizó bajo condiciones de desnaturalización SDS en un gel de poliacrilamida. Las proteínas se electro-transfirieron del gel a membranas de nitrocelulosa (Amersham). Las membranas se saturaron durante 1 h en Tris-solución salina tamponada (TBS) que contenía 0,1% de Tween 20 y 1-5% albúmina de suero bovino. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos dirigidos contra de longitud completa (FL) eIF2α (1: 1000), fosfo-eIF2α (1: 1000). anticuerpos conjugados con peroxidasa secundaria se utilizaron a 1: 5.000 para la proteína de longitud completa y 1: 2.000 para las proteínas fosforiladas. Revelación hecho por ECL o ECL + métodos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham). La cuantificación se realizó utilizando el programa NIH Image de dominio público (escrito por Wayne Rasband en los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos).

In vivo la síntesis de proteínas

Activid ad de síntesis de proteína se midió in vivo : embriones (5% de suspensión en agua de mar) se cultivaron en presencia continua de [ 35 S] - L -metionina a la concentración final de 5 Ci / ml o, alternativamente, los lotes de embriones se tomaron 2 h después de fertilización y se incubaron en presencia de [ 35 S] - l metionina durante 30 min a una concentración final de 10 Ci / ml. [ 35 S] - L -metionina incorporación en proteínas se midió en alícuotas duplicados después de la precipitación con TCA 10% en Whatman 3 filtros M y contando en un contador de centelleo en presencia de Optiphase Supermix líquido de centelleo como se describe en Le Bouffant et al. (2008) .

Clonación y mutagénesis dirigida al sitio

Forward (5 'GGGGGGGGATCCCCGATTTCGTGTCGATTCTACGAG-3') e inverso (5 'CCCCCCGAATTCTTAGTCTTCCTCGTTTCCAATTTCTTCC-3') cebadores diseñados a partir de la purpuratus Strongylocentrotus genoma se utilizaron para amplificar un fragmento de 938 pb por PCR utilizando un S. purpuratus biblioteca de ADNc. El fragmento de 938 pb (secuencia de EMBL XP779939) fue digerido por EcoRI y BamHI y se insertó en el plásmido pGEX4T-1 (GE Healthcare) cortado con las mismas enzimas para obtener el de tipo salvaje GST-eIF2α clon. Los mutantes se obtienen por mutagénesis dirigida al sitio de los plásmidos pGEX-eIF2α usando el QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) de acuerdo con el fabricante, con los siguientes cebadores:

S51D = 5 'ATGATCCTGCTCAGTGAGCTGGATAGAAGGCGTATCAGATCCATC-3' y 5'-GATGGATCTGATACGCCTTCTATCCAGCTCACTGAGCAGGATCAT-3 ',

S51A = 5 'CTGCTCAGTGAGCTGGCGAGAAGGCGTATCA-3' y 5'-TGATACGCCTTCTCGCCAGCTCACTGAGCAG-3 ').

Los mutantes y los insertos de tipo salvaje se verificaron por secuenciación en un secuenciador automático de Applied Biosystems AB3130 en la instalación de núcleo Biogenouest® Genómica en Roscoff (Francia).

la purificación de proteínas de fusión

Los plásmidos que contienen la GST-eIF2αS51D o GST-eIF2αS51A o GST solo se insertaron en Rosetta cepa bacteriana competente (Novagen). Las proteínas se expresaron en cultivos de una noche a 20 ° C con agitación vigorosa. Se indujo la proteína sobre-expresión durante 3 h mediante la adición de 0,5 mM isopropil β- d -1-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 OD A 600 . Las células sedimentadas se resuspendieron en 1 × Phosphate-Buffered Saline (PBS) con anti-proteasas (AEBSF 1 mM, 2 mg / ml de leupeptina y 10 mg / ml de aprotinina) y se rompieron utilizando una French Press. El lisado se trató con 1% de Triton X-100 30 min a temperatura ambiente. Las proteínas de fusión se purificaron en glutatión sepharose 4B bolas (GE Healthcare; perlas de 0,5 l para 1 ml de lisado a 4 ° C durante 1 h con una agitación gentil). Después de dos lavados en 1 x PBS y anti-proteasas, las proteínas de fusión se recuperaron en tampón de elución (Tris-HCl 50 mM pH 6,8, y 10 mM glutatión reducido, pH 8).

microinyección

Las proteínas de fusión se dializaron durante la noche a 4 ° C frente a tampón de microinyección (10 mM HEPES pH 7,0, KCl 200 mM, y manitol 550 mM) y se diluyeron a 600 ng / l en el mismo tampón que contiene Alexa 1 mM Fluor 488-dextrano (Molecular Probes ) para permitir la visualización de los huevos inyectados. El sistema de microinyección FemtoJet (Eppendorf) dio como resultado la inyección de aproximadamente 5% del volumen de cada huevo con una concentración final prevista de la proteína exógena de 0,4? M. La escisión fue marcado por observación bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus IX-51).

La síntesis de proteínas se midió en los huevos microinyectados utilizando un mRNA informador de luciferasa. pT7Luc plásmido (un generoso