PRUEBAS PARA LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

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de colonias discretas por el factor de dilución para estimar el número de células por mL de la muestra. Si un tubo presenta ennegrecimiento general y no hay colonias visibles, las BSR fueron consideradas demasiado numerosas para contar.

En teoría si uno o más grupos muestran ennegrecimiento general el tubo debería tener un gran número de colonias discretas contables. Cuando este no es el caso, el ultimo tubo ennegrecido es considerado en este estudio por tener >100 colonias. Por ejemplo si se inoculó una serie de cuatro tubos y los dos primeros están negros pero los otros dos no tenían colonias visibles los resultados serían reportados como >103.

MÉTODOS DIRECTOS

A diferencia de las técnicas de cultivo los métodos directos no requieren ningún crecimiento BSR durante las pruebas.

Por el contrario, para probar directamente la presencia de células BSR o para los compuestos presentes en las células BSR se estudiaron tres métodos directos.

• Ensayo de ATP

Este método estima el número total de organismos mediante la medición de la cantidad de (ATP) trifosfato de adenosina ATP en una muestra, El ATP es un compuesto que se encuentra en toda materia viva. Littman ha propuesto que las técnicas de ensayo de ATP pueden ser usados con muestras de agua, yacimientos de petróleo para estimar los números relativos de organismos, incluyendo BSR.

Este Método no se ha propuesto, ni fue evaluado en este estudio, por otra muestra de campo utiliza en relación con BSR..

El procedimiento implica filtrar una muestra para separar los sólidos y sales que podrían interferir con la prueba, A continuación se añade esta muestra filtrada a un reactivo que libera un enzima especial ATP de las células que reacciona con ATP para desencadenar, se le añade una reacción fotoquímica y de la luz emitida resultante se mide con un fotómetro. El número de células de las bacterias se estiman a partir de la luz total contada.

• Anticuerpo de superficie / Célula epifluorence

En este método, denominado en este documento como el método de ECSA, se basa en la unión de anticuerpos especificas a las células BSR. Los anticuerpos etiquetados con un compuesto fluorescente se unen solo a sitios específicos en la superficie de SRB. Cuando se observa bajo un microscopio de epifluorescencia una célula de anticuerpos ligados se identifican por un borde verde fluorescente.

El procedimiento implica la muestra a un dispositivo especial y luego de encubar durante 20 min de fijación de calor con un reactivo de anticuerpos primarios. Después de la muestra se lava para eliminar el exceso de anticuerpo, se incuba a continuación durante 20 min, con segundo reactivo de anticuerpos que contienen el compuesto fluorescente, la muestra se lava de nuevo y se añade un fluido especial de montaje y cubre objetos. El conteo se realiza a 1000x con aceite de inmersión.

Este método fue desarrollado por D.H. pope en el instituto politécnico Rensselaer, bajo contrato con el instituto de tecnología de materiales del proceso químicos industriales (MTI).

Se reconoce que si bien este método parece funcionar bien en muestras de campo y no funciona consistentemente bien en laboratorios de cultivos de BSR.

• APS anticuerpo reductasa

Estos métodos, abreviados en este documento como método de ARA, estaba en desarrollo por Du Pont Co. en el momento de este estudio. Se trata de los anticuerpos desarrollados contra la adenosina - 5 - fosfosulfato ( APS ) reductasa , una enzima que se encontró en el interior de BSR . La muestra se lava para eliminar primero los productos que puedan interferir, químicos tales como sulfuro de hidrógeno. Entonces se realiza un ultrasonido.

El resto de la prueba tiene lugar dentro de una pipeta de transferencia de polietileno. La muestra se introduce en la pipeta, se lava cuatro veces y luego se fomenta activamente una solución de color perla, Si la enzima APS reductasa está presente en la muestra (que indica la presencia de BSR) el cordón se vuelve azul dentro de 10 min. El grado de coloración es proporcional a la cantidad de la enzima en la muestra y los resultados se leen en una tabla de colores suministrada en el apéndice del kit. El gráfico permite al usuario correlacionar el color obtenido con número aproximado de BSR.

CRITERIO DE EVALUACIÓN

Los diferentes métodos fueron evaluados de acuerdo a las bases de seis criterios: exactitud, especificidad, fácil de usar, tiempo requerido para obtener los resultados, conveniencia para uso en laboratorio o campo, y las desventajas obvias y limitaciones.

• Exactitud

Para determinar exactitud relativa, las muestras que contienen números conocidos de celdas de BSR fueron evaluadas por cada método en el laboratorio. Estas muestras consistieron de culturas puras de tres diferentes presiones de Desulfovibrio desulfuricans.

• Especificidad

Mientras que la exactitud implica la habilidad de contar los números SRB totales, la especificidad es relativa a la habilidad de (1) contar todas las diferentes presiones de reductores de sulfato, y (2) reducir otros tipos de bacteria. Para investigación de laboratorio, puede ser conveniente para un método para ser muy específico para una presión de BSR; para uso de campo en general, como sea, la habilidad para detectar números de BSR totales es usualmente más conveniente. (Para citar, no existe evidencia de que una presión BSR es más destructiva que otra.)

• Fácil de usar

Algunos métodos requieren un alto nivel de entrenamiento o habilidad para uso adecuado, mientras que otros pueden ser usados con poco entrenamiento por personas relativamente poco hábiles.