En esta tercer practica hicimos pruebas bioquímicas en cultivos de bacterias seleccionados de resiembra hecha en la segunda práctica.

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-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

3-Voges-Proskuer/Rojo de Metilo

La prueba de rojo de metilo determina la producción de ácido y se requiere de organismos que produzcan ácidos orgánicos (láctico, acético, fórmico), a partir de la glucosa por la vía de la fermentación acida. El desarrollo de un color rojo estable en el medio indica la producción de ácido suficiente como para mantener el pH a 4.4 o menos, el desarrollo de un a color naranja intermedio entre amarillo y rojo indica una prueba negativa.

Pasos:

-Con el asa bacteriológica tomamos un inoculo denso del cultivo de la colonia de bacterias rojas y los suspendimos en dos tubos de caldo VP-RM.

-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

-Aplicamos el mismo procedimiento a los tubos de control sin muestra.

-Dejamos incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

4-Citarto de Simmons

La utilización del citrato por una bacteria se detecta por la formación de productos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato, también pueden extraer el nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco, llevándola a la alcalinización del medio por la conversión del amoniaco en hidróxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol es amarillo a pH menor de 6 y azul a pH mayor de 7.6, el cual es el indicador.

Pasos:

-Con el asa bacteriológica tomamos una muestra ligera del cultivo de la colonia de bacterias rojas y lo sembramos en forma de estría abierta sobre el área inclinada del medio de Citrato de Simmons, sin punzar la capa profunda del medio.

-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

-Aplicamos el mismo procedimiento a los tubos de control sin muestra.

-Dejamos incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

5-Indol

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de utilizar triptófano produciendo indol, ácido pirúvico y amoniaco. El indol puede detectarse en un medio de prueba triptófano observando la aparición de color rojo luego de agregar una solución que contiene p-dimetil-aminobenzaldehído (reactivo de Kovac).

Pasos:

-Con el asa bacteriológica recta, colocamos una muestra del cultivo de la colonia de bacterias rojas, lo sembramos por picadura en el medio SIM introduciendo dicha muestra por el centro y a 3 mm del fondo del tubo y extraíamos el asa siguiendo la estría formada al picar el medio.

-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

-Aplicamos el mismo procedimiento a los tubos de control sin muestra.

-Dejamos incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

6-Caldo urea

Los microrganismos que poseen la enzima ureasa hidrolizan urea, liberan amoniaco y producen un color rojo-rosado en el medio.

Pasos:

-Con el asa bacteriológica recta, colocamos una muestra del cultivo de la colonia de bacterias rojas y los sembramos en el caldo urea.

-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

-Aplicamos el mismo procedimiento a los tubos de control sin muestra.

-Dejamos incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

7-Agar Hierro Triple Azúcar (TSI)

El principio de fermentación de hidratos de carbono se basa en los estudios de Pasteur en bacterias y levaduras, que afirman que la acción de muchas especies de microrganismos sobre sus sustratos de hidrato de carbono da como resultado la acidificación del medio. La utilización de los carbohidratos se puede determinar con el agar Hiero Triple Azúcar. El medio contiene carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, se determina cuál de los tres puede ser fermentado por las bacterias. Una reacción de pico de flauta alcalino/profundidad alcalina (sin cambio), en este medio indica ausencia de producción de ácido y una incapacidad el microorganismo para fermentar la glucosa y otros hidratos de carbono presentes. Esta sola reacción es suficiente para excluir un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae.

Pasos:

- Con el asa bacteriológica recta, colocamos una muestra del cultivo de la colonia de bacterias rojas y los sembramos por picadura en el fondo y en forma de estría en la superficie.

-Aplicamos el mismo procedimiento para la colonia de bacterias blancas.

-Aplicamos el mismo procedimiento a los tubos de control sin muestra.

-Dejamos incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

II. Observación microscópica de los cultivos seleccionados.

-Realizamos la tinción de Gram en los cultivos de las colonias desarrolladas en la resiembra.

Al finalizar la práctica lavamos con agua y jabón, y desinfectamos con hipoclorito de sodio al 10% la mesa de trabajo.

Guardamos y refrigeramos a 4°C las cajas de Agar MacConkey del cultivo etiquetado.

Depositamos la basura en el cesto destinado.