Apuntes proteómica

...

Generalidades

- Técnica electroforética que permite la separación de una proteína basándose en su carga(IEF) y masa (SDS-PAGE)

- Permite separar hasta miles de proteínas en un solo experimento

- Su principal aplicación es en la proteómica de expresión

Principios generales

- Técnica:

- Cualquier molécula cargada migrará al aplicársele un campo eléctrico

- El grado de migración dependerá de la fuerza del campo eléctrico y de la densidad de carga de la molécula. Relación carga-masa.

Importancia

- La 2DGE puede revelar virtualmente TODAS las proteínas presentes en una célula o tejido incluyendo aquellas con modificaciones postraduccionales.

- Una muestra contiene 100-300mg de proteína total genera 1000 – 2000 manchas (proteínas)

- En condiciones particulares en laboratorios especializados, el número puede llegar hasta 10, 000.

Ventajas

- Alta resolución

- Permite el empleo de varios métodos de tinción (lo que incrementa la sensibilidad)

- Es sencillo elaborar el gel

- Fácil extracción proteica del gel

- Parámetros de separación ortogonales

- Cada dimensión es capaz de resolver 100 – 200 proteínas. Combinadas 10,000 en geles de 20 x 20 cm.

Aspectos técnicos

- Normalmente la 2DGE se aplica en el siguiente orden:

- Realizar 1D: IEF

- Cambio de buffer

- Poner en contacto directo el gel 1D con el gel 2D (SDS-PAGE)

- Detectar spots de las proteínas separadas

- Realizar modificaciones necesarias para obtener la separación deseada.

Puntos críticos

- Preparación de la muestra

- Todas las proteínas solubilizadas de manera estable

- Prevenir que haya interaccione proteínas-proteínas o interacciones hidrofóbicas

- Eliminar cualquier contaminación con DNA o RNA

- Prevenir oxidación, degradación proteolítica o alteración conformacional

- Cantidad de proteína: puede variar de mg a 1g, dependerá del gel y del interés que se tenga.

- Numero de spots: dependiendo del organismo y su estado metabólico se obtendrán 10,000 y 150,000 productos de genes

- Espectros del punto isoeléctrico: pH 3-13, sin embrago en la práctica este rango es técnicamente problemático por lo que se utiliza un pH máximo de 11.5

- Reproducibilidad: es de gran importancia pues de lo contrario es imposible encontrar variaciones proteicas entre diferente muestras.

Limitaciones

- Técnica muy laboriosa y difícil de automatizar

- No resuelve proteínas muy grandes o hidrofóbicas (no entran al gel 1D)

- Proteínas muy ácidos o muy básicas no se resuelven bien.

- Detección deficiente de proteínas poco abundantes (proteínas regulatorias, receptores).

Aplicaciones futuras

- Análisis y caracterización de subproteomas

- Caracterización de complejos proteicos.

1D: isoelectroenfoque

- Separación en base a la carga neta de una proteína

- Principio: electroforesis se realiza en un gradiente de pH, permitiendo que cada proteína migre de acuerdo a su punto isoeléctrico (pI).

- pH>pI: carga negativa

- pH=pI: carga neutra

- pH

- Ánodo tiene carga positiva

- Cátodo tiene carga negativa

Como se establece el gradiente

- Empleo de anfolitos portadores sintéticos: que son pequeñas poliaminas (cerca de 750kDa) con abundante grupos ácidos y básicos. Con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0

- Tienen una alta capacidad de tamponamiento y solubilidad cerca del pI

- Buena conductividad eléctrica

- Ausencia de efectos biológicos

- Bajo peso molecular

- Síntesis química para su preparación

Principio del IEF

- La disolución de anfolitos se emplea en la preparación de un gel de poliacrilamida.

- Al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI.

- Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel.

Limitaciones del uso de anfolitos

- Las moléculas no se unen covalentemente al gel.

- Para asegurar que los anfolitos se encuentren en el pI correcto, se necesita un tiempo largo de migración.

- Debido a lo anterior, se puede presentar la deriva catódica (desplazamiento de los anfolitos)

- Se puede minimizar adicionando urea y glicerol para equilibrar la solución evitando la formación del H3O.

Para evitar la deriva catódica, se creó el Gel IPG cuyo gradiente de pH se encuentra inmovilizado mediante las “inmobilinas”